石榴皮水提物对猪源多重耐药大肠杆菌的抑菌作用研究

【目的】筛选腹泻仔猪中携毒力基因且多重耐药的大肠杆菌菌株,评估中药水提物对该菌株的抑菌活性,并探索中药抑菌机制。【方法】通过PCR方法与Kirby-Bauer(K-B)药敏纸片法评估临床大肠杆菌菌株的肠毒素基因携带情况和耐药性;通过微量肉汤稀释法评估中药水提物对多重耐药大肠杆菌菌株的抑菌活性,确定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC);通过电导率仪以及相关试剂盒检测评估石榴皮水提物对多重耐药菌株作用不同时间后菌液电导率、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)含量及菌体内ATP含量的变化;通过SDS-PAGE和蛋白含量检测评估菌体内可溶性蛋白的含量变化;通过扫描电镜观察大肠杆菌形态变化。【结果】PCR检测14株临床大肠杆菌中肠毒素基因携带率达到78.57%,抗生素药敏试验结果显示,所有菌株至少对2种抗生素耐药,均属于多重耐药菌株。中药药敏试验结果显示,黄连、黄芩、石榴皮水提物对多重耐药菌株抑菌活性较好,其中石榴皮水提物的MIC和MBC分别为31.25和62.5 mg/mL。石榴皮水提物在1/2MIC和MIC浓度下能显著抑制质控菌株和多重耐药菌株的生长繁殖。在石榴皮水提物作用大肠杆菌3 h内,菌液电导率相比于对照组极显著上升(P<0.01)。AKP与ATP检测结果显示,与对照组相比,石榴皮水提物在作用大肠杆菌6 h内,菌液中AKP含量极显著增加(P<0.01),菌体内ATP含量极显著降低(P<0.01)。SDS-PAGE和蛋白含量检测结果显示,随着石榴皮水提物刺激时间增加,菌体内可溶性蛋白含量减少。扫描电镜结果显示,石榴皮刺激后菌体形态发生碎裂和溶解。【结论】本研究结果表明,石榴皮水提物能显著抑制多重耐药且携带肠毒素基因的大肠杆菌生长,为临床治疗大肠杆菌性仔猪腹泻提供理论参考和药物开发依据。

维生素D在猪日粮中的应用研究进展

维生素D(VD)是维持动物机体健康稳定的一种脂溶性营养素,可以通过调节钙、磷稳态以及骨骼肌发育和免疫系统等改善动物机体的健康。VD_(3)及其代谢产物25-羟基维生素D_(3)(25(OH)D_(3))在猪日粮中的应用也格外受到重视。VD可以通过调节仔猪免疫反应,抑制病原微生物感染,缓解生长受阻;可以通过其较强的抗氧化能力,改善肌肉品质;在妊娠和哺乳日粮中补充VD,可以改善母猪繁殖性能和泌乳性能,增加后代仔猪血液中25(OH)D_(3)的水平。文章就VD在仔猪、生长育肥猪和种猪生产中的应用效果进行综述,为VD在生猪实际生产中的应用提供参考。

母猪初乳中猪流行性腹泻病毒SIgA抗体ELISA检测方法的建立及应用

为了建立检测母猪初乳中猪流行性腹泻病毒分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的方法,本研究将原核表达的刺突蛋白S1作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗猪免疫球蛋白A(Ig A)的单克隆抗体作为二抗,并利用棋盘法确定了最优反应条件:S1蛋白的包被量为400 ng,二抗的稀释倍数为250倍,二抗的反应时间为45 min。对该检测方法的特异性、敏感性及重复性鉴定结果显示,母猪初乳中猪流行性腹泻病毒SIgA的检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点。利用建立的ELISA方法对母猪分娩后不同时间采集的乳汁样品进行测定,发现不同时间点的乳汁样品中SIgA含量具有一定的消长规律,结果与其他文献报道的基本一致。该方法的建立为评价猪初乳中SIg A的抗体水平及PEDV疫苗的黏膜免疫效果提供了技术手段。

牛支原体疫苗研究进展

牛支原体(M.bovis)是牛的重要病原体,能够引起牛的乳腺炎、关节炎和肺炎等疾病。牛支原体已在全世界传播,对全球范围内的养牛业产生了重大不利影响。目前,由于牛支原体的耐药性有增强的趋势,同时缺乏有效的疫苗和治疗方法,这严重阻碍了牛支原体感染的控制。预防、控制甚至清除牛支原体最好的方法是使用有效的疫苗。虽然目前我国还没有获得新兽药证书的牛支原体疫苗,但相关的研究已取得了一定的进展。本文根据多年来牛支原体疫苗研究的相关资料,从牛支原体感染与免疫机制、灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程疫苗四个方面进行综述,以期为今后牛支原体疫苗的研制提供思路及参考。

猪传染性胃肠炎病毒入侵细胞及逃避天然免疫机制研究进展

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是全球范围内造成仔猪腹泻的原因之一,且常造成混合感染和继发感染,仔猪死亡率可达100%。猪氨肽酶N是TGEV的特异性受体,唾液酸对TGEV有保护作用,如保护TGEV通过胃酸时不会失活。TGEV可以诱导I型干扰素在肠道产生,结构蛋白M、E和非结构蛋白nsp14在其中发挥着重要作用。TGEV已经发展出一系列策略来对抗宿主天然免疫反应,包括基因组中的GAIT样结构、ORF7、非结构蛋白nsp1等自身因素,以及操纵宿主细胞途径,如非折叠蛋白反应。

猪德尔塔冠状病毒CH7328株的致病性及全基因组序列分析

为了解猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)CH7328株的致病性,并分析其基因变异和遗传演变规律,试验通过病毒培养、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒生长曲线及仔猪致病性试验鉴定病毒的生长特性和致病性,并分析该毒株的全基因组序列。结果显示,感染PDCoV CH7328株的ST细胞出现肿大变圆、细胞呈碎玻璃状且拉丝、细胞集聚成簇和脱落等病变。IFA结果显示,PDCoV CH7328株主要分布在细胞质中。生长曲线结果显示,PDCoV CH7328株在6 h就已开始增殖,在36 h时达到峰值,对应的TCID_(50)为10^(-8.0)/mL,随后逐渐下降。仔猪致病性结果显示,攻毒组仔猪出现腹泻、脱水和厌食等临床症状,仔猪小肠明显变薄、透明而充盈,小肠绒毛严重脱落、萎缩或减少、肠绒毛细胞坏死等。粪便病原检测结果显示,在攻毒第2天便能检测到病毒,之后排毒持续增加,而正常对照仔猪无任何临床现象。全基因组测序及序列分析显示,PDCoV CH7328株的基因组全长为25420 bp,与国内GD株的相似性最高,达到99.9%;遗传演化结果显示,PDCoV CH7328株与国内HKU15-155、CHN-HN-2014和GD株处在同一进化分支,亲缘关系最近。本研究结果为中国PDCoV疫苗候选株的筛选及猪场疫病防控提供了参考数据和理论依据。

蛋氨酸代谢及其对动物繁殖性能的影响研究进展

蛋氨酸是畜禽的一种必需氨基酸,在动物体内可参与蛋白质合成,同时作为重要的甲基供体参与修饰组蛋白、DNA和RNA的甲基化,通过氨丙基转移途径合成多胺调控胎儿生长发育,通过硫基转移途径参与抗氧化物质生成发挥抗氧化作用,对动物生长发育和繁殖性能具有重要意义。本文就蛋氨酸结构特点与功能、蛋氨酸及其代谢产物的代谢途径及对动物繁殖性能的影响进行综述,旨在为畜禽生产中蛋氨酸的合理利用提供理论参考。

轮状病毒感染及其免疫逃逸与疫苗研究进展

轮状病毒感染可使感染者(人或动物)出现严重的腹泻,年龄较小、较大或免疫系统功能障碍的感染者都可能出现严重脱水等症状,严重者可导致死亡。全球每年约20万婴幼儿因轮状病毒感染而死亡,给世界公共卫生事业带来巨大挑战。同时,在农业生产方面,猪、牛、羊等关乎民生的经济动物的幼仔,也会因感染轮状病毒而死亡,对养殖业造成一定的经济损失。本文从轮状病毒的基因组特征、感染与增殖特点、诱导机体的免疫应答以及疫苗现状进行了总结,为开发轮状病毒相关疫苗或治疗药物提供借鉴。

猪流行性腹泻及其疫苗研究现状

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起猪群病毒性腹泻的主要病原之一,给我国乃至世界养猪业造成巨大经济损失。临床上7日龄以内的仔猪发病率最高,病死率可达100%,目前,疫苗仍是预防PEDV的重要手段。本文从流行病学、临床症状与疫苗研究现状等方面分析传统疫苗免疫效果差的原因,阐述PEDV的基本情况及其免疫防控,为新型疫苗研制提供理论参考。

英德市某规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验

为确定广东省英德市某规模化猪场传染性病原,对该猪场送检病料进行猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原检测,并进行细菌分离,对优势菌落经革兰氏染色、生化反应及16S rRNA基因PCR检测测序,确定仔猪感染副猪嗜血杆菌;药敏试验结果表明,该分离株对恩诺沙星、环丙沙星较为敏感。PCR检测结果显示病料中猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原阴性。根据药敏试验结果,为规模猪场防控副猪嗜血杆菌感染提供用药指导与防控建议,实施效果较好。

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E0和E2蛋白,并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性,为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段,运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体,构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清,通过间接ELISA方法测定抗体水平,间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示,37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下,E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达,经纯化复性后免疫小鼠,制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白,制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。

猪细小病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫原性评估

利用原核表达载体pET28a和pColdⅠ与猪细小病毒VP2基因分别构建重组表达质粒,并采用与伴侣蛋白共表达和低温诱导表达猪细小病毒VP2蛋白,并以电镜观察、血凝效价测定等进行鉴定。结果显示,2个表达载体均能对重组蛋白进行可溶性表达。冷休克载体组pColdⅠ-VP2蛋白在上清中表达效率更高且杂蛋白较少,诱导时不需要额外添加L-阿拉伯糖,表达过程工艺相对更简单。纯化后的pColdⅠ-VP2蛋白具有一定的免疫反应性,能在体外组装成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),且具有血凝活性,使用206佐剂混合乳化重组蛋白免疫豚鼠后,血清中能检测到高滴度血凝抑制抗体。上述结果为进一步研究新型安全高效的猪细小病毒疫苗提供了数据支持。

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R2(P)=0.9994和R2(T)=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数(CV)均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%(6/114)和8.8%(10/114),混合感染检出率为4.6%(5/114),比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。

两种化学消毒剂对猪流行性腹泻病毒的灭活效果观察

目的观察2种化学消毒剂对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的灭活效果.方法采用细胞培养法和悬液定量病毒灭活试验方法,对过硫酸氢钾复合盐和二氧化氯泡腾片2种化学消毒剂灭活PEDV的效果进行观察.结果在常温下,用浓度为115 mg/L的过硫酸氢钾复合盐或300 mg/L二氧化氯的消毒泡腾片水溶液对悬液内PEDV作用5 min,对悬液内浓度为105.25 TCID50/0.1 mL的PEDV灭活对数值>4.0.结论过硫酸氢钾复合盐和二氧化氯泡腾片对PEDV均有较好的杀灭作用.

唾液乳杆菌CICC23174株全基因组测序及功能分析

为探究唾液乳杆菌CICC23174株的生物学特性和基因功能,本研究以从鸡肠道分离得到的唾液乳杆菌CICC23174株为研究对象,通过使用二代测序平台HiSeq2000进行测序,利用多种生物学信息软件对原始数据进行组装和优化,并对其基因信息进行功能注释、细菌素和信号肽预测、基因共线性比较和分子进化树分析。基因预测结果表明,唾液乳杆菌CICC23174株基因组大小为203542 bp,GC含量约为32.84%,基因组特征显示其编码基因1890个,含有3个细菌素和50个信号肽。重要的是,唾液乳杆菌CICC23174株含有27个特有基因,构成4个系统分别为Ⅰ型-CRISPR-Cas基因防御系统、Ⅱ型毒素-抗毒素系统、肿瘤抑制基因和蛋白分泌途径。而且基因共线性分析发现CICC23174株与模式菌株UCC118唾液乳杆菌最为相似,但是16S rRNA分子进化树结果表明CICC23174株与唾液乳杆菌FZJTZ9M6株遗传距离较近。本研究结果为丰富唾液乳杆菌的物种进化库,挖掘唾液乳杆菌潜在的益生功能奠定了基础。

两种消毒剂对猪链球菌和副猪嗜血杆菌的杀灭效果

目的观察过硫酸氢钾复合盐和二氧化氯泡腾片对猪链球菌和副猪嗜血杆菌的杀灭效果,为畜牧养殖场消毒提供依据。方法采用悬液定量杀菌试验法,对过硫酸氢钾复合盐和二氧化氯泡腾片对猪链球菌和副猪嗜血杆菌的杀灭效果进行观察。结果室温下浓度为57.5 mg/L过硫酸氢钾复合盐对悬液内猪链球菌和副猪嗜血杆菌作用5 min,杀灭对数值>5.00。用浓度为0.63 mg/L二氧化氯对悬液内猪链球菌和副猪嗜血杆菌作用5 min,杀灭对数值>5.00。2种消毒剂在试验温度10~30℃范围内,杀菌效果随温度升高而提高。结论过硫酸氢钾复合盐和二氧化氯泡腾片对猪链球菌和副猪嗜血杆菌均有较好的杀灭效果,升高温度有助于提高杀灭效果。