猪流行性腹泻灭活疫苗临床应用研究

PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)引起的产房仔猪腹泻是目前危害养猪业的主要三大传染病(ASF、PRRS、PED)之一,给养猪业造成巨大的经济损失。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。为了进一步验证改进后止泻威对PED的防控效力,本研究在湖南浏阳某发病猪场评价了其在临床上对产房仔猪的保护效果。从产房仔猪腹泻率及抗体水平分析,止泻威疫苗免疫具有良好的免疫保护效力,表明该疫苗为产房仔猪PED的防控提供了更有效的措施。

猪病毒性腹泻灭活疫苗保存期试验的研究

PEDV引起的产房仔猪腹泻是目前危害养猪业的主要三大传染病(ASF、PRRS、PED)之一,给养猪业造成巨大的经济损失。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。为保证猪病毒性腹泻灭活疫苗在有效期内使用是安全、高效、稳定的,将制备的腹泻苗置2~8℃保存,选择保存0、3、6、10、13个月的疫苗进行性状及效力检验。结果表明,保存13个月内疫苗性状稳定,免疫PEDV双阴性猪,血清PEDVELISA抗体和中和抗体效价均无明显变化,且显著高于竞品苗。实际应用中,疫苗按规定条件储存,在有效期内使用是有效的。

猪病毒性腹泻灭活疫苗对仔猪保护力研究

PEDV引起的产房仔猪腹泻是目前危害养猪业的主要三大传染病(ASF、PRRS、PED)之一,给养猪业造成巨大的经济损失。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。为了提高疫苗的保护效果,本研究小组对PEDV疫苗在病毒含量、佐剂等方面进行了大幅改进,本文总结了改进后的疫苗免疫怀孕母猪,初生仔猪从母猪乳汁获得被动保护的研究结果,表明该疫苗为产房仔猪PED的防控提供了更有效的措施。

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪干扰素-β免疫压力下传代后的变异研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪干扰素-β(swIFN-β)免疫压力下的分子变异情况,本研究将高致病性PRRSV JXA1株在添加适量swIFN-β的Marc-145细胞中连续传20代后,获得PRRSV-A1βf20株及正常传代对照株PRRSV-A1f20。序列分析结果显示:PRRSV-A1βf20与PRRSV-A1f20在NSP2、ORF3、ORF5和ORF6等基因中累计分别出现43个和14个核苷酸突变,并分别导致24个和6个氨基酸改变,有义突变与沉默突变比值(NS/S)分别为3和0.625,两者的氨基酸突变速率比为400%。PRRSV-A1βf20株的ORF5、NSP2、ORF3和ORF6的氨基酸突变率为4.5%、3.8%、2.3%和0.57%,NS/S比值为7、3.3、2和1,远高于PRRSV-A1f20株氨基酸突变率和NS/S比值。上述结果表明:在swIFN-β存在时,PRRSV变异显著加快,呈现明显的压力选择性突变;swIFN-β的选择压力对PRRSV的ORF5基因变异影响最大,NSP2次之,属于免疫突变正向效应,而对ORF3基因影响最小,对ORF6几乎无影响。推测PRRSV的NSP2和ORF5基因可能在PRRSV对swIFN-β的免疫逃逸中起重要作用。本研究首次报道了PRRSV在swIFNβ免疫压力下遗传变异加快的正向效应。

超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氨苄西林及其代谢物残留

建立一种同时测定鸡蛋中氨苄西林及其主要代谢物氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的超高效液相色谱串联质谱方法。样品经乙腈水溶液(70∶30,V/V)提取、浓缩、SAX固相萃取小柱净化后,采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测。结果显示,氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪在1~200 ng/g的浓度范围内呈良好的线性关系。在鸡蛋中氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的检测限均为0.5 ng/g,定量限为1 ng/g。在1~100 ng/g添加浓度范围内,氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪在鸡蛋中的平均回收率分别为84.0%~96.2%、85.6%~96.4%和89.2%~95.8%,批内、批间RSD均小于10%。添加不同浓度药物的鸡蛋样品具有良好的长期冷冻放置稳定性和反复冻融稳定性。蛋鸡在服用氨苄西林后,所产鸡蛋均能检出氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪,且氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的残留量和残留时间高于氨苄西林原型。上述内容表明,该方法各项技术指标均能满足残留检测要求,可用于定量测定鸡蛋中氨苄西林及其主要代谢物的残留量。

Ⅰ群4型禽腺病毒感染鸡阳性血清的制备及其在IFA中的应用

用LMH细胞扩繁I群禽腺病毒血清4型(FAd V-4)并通过口服途径感染24周龄SPF公鸡,心脏无菌采血制备鸡抗FAdV-4血清。通过ELISA、AGP、IFA和HI等方法检测血清,结果未见其他禽类常见病毒抗体。该血清用于间接免疫荧光检测FAd V-4,染色效果较好,测定FAID50敏感性高。试验结果表明,该批血清2000倍稀释可以作为一抗用于FAd V-4毒价检测。

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白,制备相应的多克隆抗体,根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成,随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组杆状病毒质粒,再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示,B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应,并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白,B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠,制备小鼠多克隆抗体,经间接ELISA检测,该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

高铜日粮对肉鸡肝脏TrxR2基因mRNA表达和还原活性的影响

本文旨在了解高铜日粮对肉鸡肝脏TrxR2基因mRNA表达和还原活性的影响。200羽1日龄Cobb商品代肉鸡随机分为4组,各组日粮中铜含量分别为:对照组(Ⅰ组)11mg.kg-1、试验Ⅱ组110mg.kg-1、试验Ⅲ组330mg.kg-1和试验Ⅳ组550mg.kg-1。饲养至10、30、50d时每组各取5只鸡用于采集肝脏样品,提取肝脏线粒体用DTNB法测定肝脏TrxR2的还原活性,提取肝脏总RNA用RT-PCR法测定TrxR2mRNA在肝脏中的表达量。结果显示,饲喂铜含量为550mg.kg-1日粮50d时还原活性降低(P<0.05)、TrxR2基因mRNA的表达量降低(P<0.05),饲喂铜含量为330mg.kg-1日粮30d时TrxR2的还原活性升高(P<0.05)、50d时降低(P>0.05),表明饲喂高铜日粮(330～550mg.kg-1)可导致TrxR2mRNA在肝脏中的表达量降低,还原活性先升高后降低。

高铜日粮对肉鸡肝脏抗氧化功能的影响

选用1日龄健康商品代AA肉鸡200只随机分成4组,使用硫酸铜作为铜源,饲喂玉米-豆粕型基础日粮,对照组饲料铜含量为11mg/kg,3个试验高铜组饲料铜含量分别为110、330和550mg/kg,试验至50日龄结束,探讨高铜日粮对肉鸡肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量的影响。结果显示:110、330和550mg/kg组T-AOC、SOD和GSH-Px活性先呈代偿性升高,后表现降低,而CAT和MDA分别表现为代偿性下降和升高。表明日粮铜含量为330mg/kg及其以上可引起肝脏抗氧化功能受损,最终导致肝脏功能紊乱。

华南地区致病性猪大肠杆菌的鉴定和血清型分布

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的猪肠道传染性疾病，其主要危害1月龄以内的仔猪。根据发病Et龄及临床症状可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿3种。该病的发病率与死亡率均很高，

高铜日粮对肉鸡肝抗氧化功能和肝细胞凋亡的影响

选用200只1日龄健康商品代AA肉鸡,随机分成4组,使用硫酸铜作为铜源,饲喂玉米―豆粕型基础日粮,对照组饲料铜含量为11mg/kg,3个高铜试验组饲料铜含量分别为110、330和550mg/kg,试验至50日龄结束,探讨高铜日粮对肉鸡肝抗氧化功能和肝细胞凋亡的影响。结果显示,3个高铜试验组超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性先呈代偿性升高,后表现降低,丙二醛(MDA)表现为代偿性升高。随着饲养周期的延长和日粮铜含量的增加,高铜组肉鸡肝细胞凋亡率升高并逐渐出现比较明显的DNA断裂条带。结果表明,日粮铜含量为330mg/kg及其以上可引起肝脏抗氧化功能受损,肝细胞凋亡率升高。

铜对肉鸡原代肝细胞活性及糖原含量的影响

为了探讨铜对肉鸡原代肝细胞活性及糖原含量的影响,试验分别用10,50,100μmol/L Cu2+在体外孵育原代肝细胞,PAS染色后测定30分钟和1,2,4,24,48,72小时各时间点的原代肝细胞活性及24小时时的糖原含量。结果表明:50μmol/L和100μmol/L Cu2+仅分别在72小时和4小时之后明显降低细胞活性;随着铜浓度的升高,糖原含量减少。说明高浓度铜可降低原代肝细胞活性,促进肝糖原分解。

猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白亚单位疫苗免疫效果观察

用超声波破碎并采用N-十二烷基肌氨酸钠进行猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白提取,提取物经SDS-PAGE电泳检测后制备成疫苗,以肌肉注射方式免疫SPF小鼠,于免疫前及免疫后每隔1周分别收集血清。以间接ELISA的方法检测血清中IgG抗体水平,同时用不同血清型大肠埃希菌菌株与免疫血清做玻板凝集试验和攻毒保护试验。结果表明,在免疫小鼠后的第28天左右机体内的抗体水平达到最高值,免疫血清能够与不同菌株发生凝集反应且不同菌株对小鼠的攻毒都具有免疫保护力,说明外膜蛋白不仅具有一定的免疫原性而且对不同菌株具有交叉免疫保护力,因此外膜蛋白亚单位疫苗作为一种新型疫苗可望适用于防控猪大肠杆菌病。

稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立

旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素酶相关基因的融合序列SP-EGX-F2A-BGL1,构建腮腺特异性表达载体pPSP-SP-EGX-F2A-BGL1-CMV-NEO-T2A-EGFP,经PCR、酶切、测序鉴定正确后,通过脂质体转染猪胎儿成纤维细胞,利用G418抗性和绿色荧光蛋白进行稳定筛选,并利用PCR和Western blot进行检测。结果表明,成功构建了带双筛选标记的腮腺特异表达纤维素酶基因的表达载体,并获得稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系。该结果为生产腮腺特异表达纤维素酶的转基因克隆猪研究奠定基础。

维生素C对铜孵育的肉鸡原代肝细胞周期及细胞膜电位的影响

为了研究维生素C对铜孵育的肉鸡原代肝细胞周期及细胞膜电位的影响,试验将全量换液24 h后的原代肝细胞分为正常对照组(Ⅰ组)和10μmol/L Cu2+(Ⅱ组)、30μmol/L Cu2+(Ⅲ组)、50μmol/L Cu2+(Ⅳ组)、50μmol/L维生素C+50μmol/L Cu2+(Ⅴ组)刺激组,于体外刺激后48小时用流式细胞仪测定各组的细胞周期及细胞膜电位。结果表明:30μmol/L和50μmol/L Cu2+能明显引起静止期肝细胞数增多,增殖期肝细胞数减少,细胞膜电位下降(P<0.05),10μmol/L Cu2+组没有出现明显变化。说明维生素C可显著抑制50μmol/L Cu2+引起的变化,对细胞具有保护作用。

猪大肠杆菌融合菌株R2灭活苗的研制及免疫试验

为了研究猪大肠杆菌融合菌株R2蜂胶灭活苗的免疫效果,试验以猪大肠杆菌原生质体融合菌株R2为菌种制备蜂胶灭活苗,采用肌肉注射方式免疫SPF小白鼠,以间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平,同时用2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株与免疫血清做玻片凝集试验,并对小白鼠进行攻毒保护试验。结果表明:该疫苗免疫性能较好,在免疫小白鼠后的第28,35天左右机体内的抗体水平达到最高值,融合菌株R2蜂胶灭活苗可对2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株的攻毒试验产生保护,而且安全性能良好,是一种效果较好的菌苗。说明融合菌株R2蜂胶灭活苗作为一种新型疫苗防控猪大肠杆菌病将成为一种可能。

PRRSV-GP5蛋白对干扰素调节因子-3磷酸化的影响

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)-GP5蛋白对干扰素调节因子-3(IRF-3)磷酸化的影响,试验根据PRRSV CH-1a毒株核苷酸序列,设计并合成用于扩增PRRSV-GP5基因的特异引物,将目的基因扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,转染Marc-145细胞,间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达,应用SDS-PAGE和Western-blot分析GP5对IRF-3的影响。结果表明:经RT-PCR扩增,得到的GP5基因大小与预期一致;间接免疫荧光试验证明,GP5蛋白在Marc-145细胞中成功表达;SDS-PAGE和Western-blot分析显示,GP5基因可以抑制IRF-3的磷酸化。

犬细小病毒广州地方株的分离、鉴定

为了研究广州地区的犬细小病毒(CPV)流行状况,试验将临床采集的5份患出血性肠炎且用CPV诊断试纸检测均为阳性的犬粪便,通过猫肾细胞(F81)传代培养,成功分离到1株病毒,并对其进行了病毒形态学、理化学、血凝谱试验、PCR鉴定与动物回归试验,对主要抗原基因VP2测序分析。结果表明:分离病毒为CPV;抗原型属于CPV-2a型。

表达Omp1和Omp2的猪大肠埃希菌融合菌株R2的构建

为了构建猪大肠埃希菌融合菌株,在药敏试验和MIC试验的基础上,对猪大肠埃希菌HY2株(O101,Omp1)和GXA1株(O107,Omp2)进行交叉耐药培育。以HY2(O101,Omp1,Ami r,Czl s)和GXA1(O107,Omp2,Czl r,Ami s)为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备两亲本菌株原生质体,通过聚乙二醇(PEG)助融,进行原生质体融合,得到3株双耐药融合菌株。结果表明,猪大肠埃希菌原生质体制备和再生的最适条件是:溶菌酶浓度为200U/mL,作用时间为25min。筛选得到3株融合菌株R1、R2、R3,均可凝集两亲本的O抗原,其中,R2凝集性更好更稳定。进一步结合SDS-PAGE分析,显示融合菌株R2能较好的表达两亲本菌株形状,经多次传代仍能够稳定遗传。