流式细胞术在农业研究领域中的应用

流式细胞术是一种对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选的生物学技术,基于流式细胞仪通过检测散射或者偶联荧光信号快速、准确、客观、高通量获得悬浮微粒(通常是细胞、细菌等微小颗粒)一系列重要的生物物理、生物化学相关特征参量,可以根据预选的参量范围对细胞、细菌等微小颗粒进行自动分析和对特定群体进行分选。流式细胞术在许多科学领域特别是生物技术和医学领域应用广泛,虽然在农业研究中的应用开始得比较晚,但目前已取得巨大进展。随着流式细胞仪性能的不断提高,标记方法和检测技术的不断开发与完善,流式细胞术的应用前景将越来越广阔,在农业领域也将发挥越来越重要的作用。介绍了流式细胞术的工作原理和流式细胞仪功能分类,综述了流式细胞术在农业研究领域中的应用,如对农作物基因组和原生质体分析以及抗逆研究,对动物免疫、微量元素分析、精子质量和性别控制以及毒素毒性分析,对病原菌和病毒分析研究等方面的应用和研究进展,展望该研究领域的发展前景,为流式细胞术在农业领域的潜在应用提供新的思考方向。

毛叶山桐子种子休眠与萌发特性的研究

目的:探究毛叶山桐子种子(Idesia polycarpa Maxim.var.vestita Diels)的休眠类型和解除休眠的最适方法,为生产实践中的种苗繁育提供一种能有效解除毛叶山桐子种子休眠和提高萌发率的方法。方法:以成熟的毛叶山桐子种子为材料,研究种子的水分透性及温度、光照、去垢剂、后熟、层积和植物激素对种子休眠与萌发的影响。结果:(1)种子具有发育成熟的胚,种皮被有蜡质层但具有透水性;(2)在10~35℃和交替光照(12 h光照/12 h黑暗,光强度为144μmol·m^(-2)·s^(-1))下萌发30 d,种子的萌发率低于30%,具有休眠特性;(3)种子在完全黑暗条件下几乎不萌发,是一种需光性种子;(4)4℃和10℃层积30 d显著地增加种子的萌发速率和萌发率,后熟90 d则对种子萌发没有影响;(5)GA3能部分解除种子的休眠和促进萌发,将萌发率提高至56.7%,氟啶酮则没有作用。结论:毛叶山桐子种子的休眠类型为非深度生理休眠,解除休眠和促进萌发的最适方法是将种子在4℃或者10℃中层积30 d,然后在25℃和交替光照中萌发。

水杨酸引发提高低温下水稻种子萌发活力的生理与分子效应

【目的】研究水杨酸(SA)引发对低温下水稻种子萌发活力的影响及生理响应,揭示SA引发对脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)代谢途径相关基因以及细胞壁松弛基因的诱导模式,为水稻种子低温萌发研究提供理论依据。【方法】以籼型三系杂交水稻泰丰优208种子为材料,通过种子引发处理,分析SA对种子低温萌发活力及生理的影响,并通过qRT-PCR技术分析ABA、GA和扩展蛋白基因响应SA引发的表达模式。【结果】低温(15℃)显著推迟水稻种子萌发进程。在低温下萌发1 d种子中,其内源SA浓度是常温(28℃)下的1.7倍;但对于5 d的幼苗而言,低温下的SA浓度仅为常温下浓度的0.6%。SA引发可有效提高种子在低温下的萌发活力,尤其以2000μmol·L^(-1)SA效果最为显著,该浓度显著提高了低温下种子的发芽指数、活力指数、芽长、根长、鲜重和干重,其中活力指数分别为未引发种子(CK1)和水引发种子(CK2)的3和2倍。在生理指标方面,SA引发提高了低温萌发过程中种子的可溶性糖、脯氨酸以及活性氧含量,增加了总淀粉酶、β-淀粉酶、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,降低了丙二醛(MDA)含量。与CK1相比,2000μmol·L^(-1)SA引发将种子ABA含量降低了79%,同时将IAA和GA1含量增加了32.2%和2.66倍。在基因表达方面,对于2000μmol·L^(-1)SA引发的种子,ABA合成基因OsNCED2和OsNCED3的表达量分别比CK1降低了94.26%和90.24%;而ABA分解基因OsABA8’ox2和OsABA8’ox3的表达量分别为CK1的5.9和3.9倍。与CK1相比,SA引发显著上调了GA合成基因OsCPS1、OsKAO和OsGA20ox1的表达量,并显著下调GA分解基因OsGA2ox2和OsGA2ox6的表达量。在几个候选的细胞壁松弛因子扩展蛋白基因中,除了OsEXPB11外,其余几个同源基因均在一定程度上被引发而上调表达。与CK1相比,2000μmol·L^(-1)SA引发分别使OsEXPA2、OsEXPB4和OsEXPB6的表达量上调12.2、5.9和6.1倍。【结论】SA引发可显著缓解低温对于水稻种子萌发和幼苗生长的影响。可能是由于SA提高SOD、CAT等抗氧化酶活性,降低MDA的产生,增加可溶性糖和脯氨酸的含量,进而增强种子和幼苗对于低温的耐受能力。另一方面,SA引发通过降低种子内源ABA含量,增加GA1含量,增强总淀粉酶和β-淀粉酶活性,促进细胞壁松弛相关基因的表达,从而促进低温下的种子萌发和幼苗生长。

箭叶淫羊藿种子的休眠类型与萌发研究

箭叶淫羊藿具有重要的药用价值和较大的市场需求,但其种子休眠和萌发特性目前仍不够清楚,严重影响了其产业化育苗与栽培。为探明其种子的休眠类型及释放休眠和促进休眠的最适方法,该文以箭叶淫羊藿的成熟种子为材料,研究种子对水分的吸收、种子的脱水耐性,以及温度、层积和植物激素对种子休眠与萌发的影响。结果表明:(1)箭叶淫羊藿种子不具有物理休眠,而具耐脱水性。(2)在4~25℃和黑暗条件下,种子萌发率为零,具有休眠特性。(3)胚与种子的比值非常小,4℃和10℃及变温层积能显著地促进胚的生长发育以及增加种子的萌发速率和萌发率。(4)赤霉素和氟啶酮显著增加种子的萌发速率和萌发率。综上认为,箭叶淫羊藿种子的休眠类型为形态生理休眠(MPD),释放休眠和促进萌发的最适方法是先将种子在10℃中层积30 d,再置于4℃环境中让其萌发。该研究结果为箭叶淫羊藿的产业化育苗提供了参考。

水稻WOX家族基因鉴定及其种子在逆境萌发中的表达分析

【目的】开展水稻WOX基因家族成员的鉴定及在种子逆境萌发中的表达分析,可为探究WOX家族基因的功能、作用机制及水稻遗传改良提供理论参考。【方法】对水稻WOX基因家族成员进行鉴定,利用生物信息学软件对其系统进化关系、理化性质、基因结构、保守结构域、保守基序、顺式作用元件和染色体定位等进行分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在种子萌发过程的时空表达特征及非生物胁迫下的表达模式。【结果】从PlantTFDB数据库鉴定获得13个水稻WOX基因家族成员(OsWOX1~OsWOX13),可分为3个分支,其中,远古进化支仅含1个基因,中间进化支和现代进化支分别含有6个基因。13个OsWOXs家族基因不均匀地分布在水稻的1、3、4、5、7、8、11号染色体上,其余5条染色体上则不含该家族基因,其基因结构之间存在较大的差异,暗示WOX基因功能具有差异性和多样性。13个水稻WOX蛋白均定位于细胞核,具有Homodomain superfamily保守结构域和10个保守基序,其中Motif 1和Motif 2位于每个蛋白的保守功能域中。OsWOXs基因启动子区域均含有较多的光响应元件和防御胁迫响应元件,种子特异性反应元件(RY-element)存在于OsWOX1、OsWOX9、OsWOX11和OsWOX12基因中。13个OsWOXs基因在水稻种子萌发及逆境胁迫下的表达模式存在明显差异。OsWOX8基因在萌发种子和幼苗中均呈较高的表达量,OsWOX9和OsWOX11基因在种子萌发期表达量较高,而OsWOX2、OsWOX6和OsWOX8基因在幼苗中的表达量较高。干旱胁迫下,幼苗中OsWOX1、OsWOX2、OsWOX4和OsWOX5基因的相对表达量分别是对照(CK)组的15.0倍、8.0倍、3.9倍和3.6倍,而种子中OsWOX3、OsWOX4和OsWOX7基因的相对表达量分别比CK组降低87.2%、86.9%和97.8%。【结论】相较于拟南芥和玉米,水稻WOX基因家族成员在系统发育进化上较先进,仅保留OsWOX8一个古老分支,且其启动子区域均含有大量光响应和胁迫响应元件,推测其在功能上偏向于参与光合作用和逆境应答方面。OsWOXs基因在水稻种子萌发、幼苗及各种非生物胁迫下呈现丰富多样的表达模式,其中OsWOX9和OsWOX11基因为调控种子萌发的关键基因。

泛素受体蛋白OsDSK2b负向调控水稻叶瘟和渗透胁迫抗性

泛素受体蛋白DSK2(dominant suppressor of KAR2)在植物生长发育和逆境胁迫中发挥重要作用,但其在水稻抗病和渗透胁迫中的作用尚未见报道。本研究发现OsDSK2b受多种逆境的调控,该基因的表达水平在稻瘟病菌侵染和20%PEG-6000处理后显著降低。时空表达分析表明OsDSK2b基因在三叶期幼苗中的表达水平最高,亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞质。接种稻瘟病菌(GD08-T13和Guy11)后,敲除植株的病斑面积约为0.05 cm^(2)和0.10~0.13 cm^(2),远小于野生型植株的病斑面积(0.24 cm^(2)和0.31 cm^(2))。敲除OsDSK2b显著增强水稻的叶瘟抗性。而且在病原菌侵染后,敲除植株中病程相关蛋白(PR)基因的表达受到明显诱导。敲除OsDSK2b也显著增强水稻的渗透胁迫抗性,20%PEG-6000模拟渗透胁迫处理后,OsDSK2b敲除植株的存活率为58.3%~74.0%,显著高于野生型植株的存活率(17.0%)。OsDSK2b敲除植株的离子渗透率和植株失水率则显著低于野生型植株。扫描显微镜的结果表明,无论在20%PEG-6000处理前后,敲除OsDSK2b能够促进气孔的闭合,且在20%PEG-6000处理后,这种促进作用会更强。此外,qRT-PCR结果表明,在20%PEG-6000处理后,OsDSK2b敲除植株中DREB基因以及脱落酸(ABA)合成或通路相关基因的表达水平显著高于野生型植株,且敲除植株ko6和ko14的内源ABA含量分别为314.2 ng g^(-1)和344.4 ng g^(-1),显著高于野生型植株的内源ABA含量(206.8 ng g^(-1)),揭示OsDSK2b参与调控渗透胁迫的过程同时涉及ABA依赖和ABA非依赖途径。本研究通过解析OsDSK2b基因在水稻应对生物与非生物胁迫时所发挥的调控作用,为水稻抗性品种的选育提供了新的候选基因。