抗体技术研究进展(1):人源抗体技术

100年来,抗体的发现为人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测发挥了巨大的作用.特别是1975年发明了单克隆抗体技术以及1986年发明基因工程抗体技术,为研制特异性高、大量均一并大量生产抗体成为了现实,也使嵌合抗体、全人源抗体造福人类并产生巨大的经济效益.为了克服鼠源性单抗可诱发人抗鼠抗体(HA-MA),通过嵌合抗体、改构抗体、小分子抗体等技术和改良抗体与抗原结合的特异性,已成为抗体技术研究的主要发展方向,本文主要就抗体人源化及抗体分子小型化,抗体功能复合化两个部分的进展进行综述.

重金属免疫学快速检测技术研究进展

重金属免疫学检测技术作为一种新型检测技术,与传统检测方法相比具有灵敏、快速、携带方便、费用低等优点,可用于现场快速检测。本文概述近年来重金属免疫学检测技术的最新研究进展,并对该类方法的发展趋势和应用前景进行展望。

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立

目的：制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）单克隆抗体，初步建立双抗体夹心 ELISA 检测方法。方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗 hAFP单抗的杂交瘤细胞株；对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析；双抗体夹心 ELISA 法筛选最佳配对抗体；初步建立DAS-ELISA 检测方法并检测血样，绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。结果共获得12株稳定分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株，其中 Ab 1-Ab 55株单抗的腹水效价均高于600万， Ab 5的效价高达3000万；特异性鉴定结果表明 Ab 1-Ab 5均能够特异识别天然 hAFP 分子，但 Ab 5与人血清白蛋白（HSA）存在较强交叉反应；抗体配对实验共筛选出5对（Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1）能够满足 hAFP 检测要求且无交叉反应的配对抗体，最终确定 Ab 1＋ Ab 3/HRP-Ab 2和 Ab 1＋Ab 3/HRP-Ab 4为最佳配对组合；利用最佳配对抗体组合建立标准检测曲线，其线性检测范围为5-250 ng/ml，最低检测限2 ng/ml，检测上限400 ng/ml，优于进口试剂盒的线性范围5-200 ng/ml 和最低检测限5 ng/ml；样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率99.2%（119/120例），阴性血清准确率100%（40/40例）。结论筛选获得的4株高亲和力、高特异性抗 hAFP 单抗均可应用于 DAS-ELISA 试剂盒的研制，Ab 1和 Ab 3适合作为捕获抗体，Ab 2和 Ab 4适合作检测抗体；自制试剂盒的线性检测范围和最低检测限均优于进口试剂盒，表明具有商用价值。

免疫磁珠富集技术进展

免疫磁珠富集技术，是以磁性微球作为固相表面，结合免疫学方法建立起的一门具有重要应用前景的样品富集手段。具有磁性的微颗粒通过结合特定抗体，在液相中能特异性地与相应抗原结合，依靠磁场的作用力快速地使所需样品量得到大大的浓缩。由于免疫磁珠富集法具有快速及特异性强的特点，在_一十余年的发展中，已广泛应用于分离及浓缩特定细胞、微生物、蛋白质和核酸片段等肉眼难以观察或样品中含量不高的物质。

重金属铬离子胶体金免疫层析快速检测法的建立

建立了水样中铬离子(Cr3+)检测的免疫试纸条检测方法。将自制的抗Cr3+-EDTA单克隆抗体标记于金颗粒后,包被于玻璃纤维上,将Cr3+-EDTA-BSA抗原和羊抗鼠IgG二抗分别结合于硝酸纤维膜上作为检测线(T线)和质控线(C线),组装试纸条。该试纸条可检测经亚硫酸氢钠还原为Cr3+的Cr6+,检出限为50μg/L;与10种重金属进行交叉实验验证,除与1 000μg/L的Fe3+有微弱交叉外,与其他重金属均无交叉反应;比较试纸条与仪器法ICP检测加标水样,两种方法的结果呈正相关。该试纸条可在3～5 min内肉眼观察结果,适用于现场检测,满足水样或土壤中重金属铬残留的监测要求。

虾、蟹交叉过敏原的研究

目的分析不同虾蟹过敏原组分间的交叉反应,探讨交叉过敏原在虾、蟹等甲壳类过敏食物检测、诊断和疫苗设计中的意义。方法运用20例虾过敏患者血清和制备的凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白的8株单克隆抗体(mAbs),通过Western blot和间接竞争ELISA分析凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹的交叉过敏反应及它们的主要交叉过敏原。结果 Westernblot的结果显示,凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹分别能与85%、85%和75%的虾过敏患者血清IgE特异性反应;间接竞争ELISA的结果显示,3种虾蟹粗提液均可显著抑制虾过敏患者血清IgE与凡纳滨对虾蛋白的结合,最大抑制率分别93%、84%、60%;8株凡纳滨对虾原肌球蛋白的mAbs与日本沼虾和梭子蟹的Western blot和间接竞争ELISA反应中,6株mAbs可与日本沼虾和梭子蟹的相对分子质量为36 000蛋白反应。结论凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹之间存在交叉过敏反应,且具有多个交叉过敏原,其中原肌球蛋白是主要的交叉过敏原。

凡纳滨对虾次要过敏原肌质钙结合蛋白的质谱鉴定及免疫交叉反应

目的:质谱鉴定凡纳滨对虾相对分子质量(Mr)为21 000的次要过敏原组分肌质钙结合蛋白(SCP),分析它与其他虾、蟹等甲壳类过敏原的免疫交叉反应,以阐明SCP可作为甲壳类食物过敏原检测、检验及脱敏的标准过敏原物质。方法:运用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定凡纳滨对虾Mr为21000的过敏原组分,利用软件BLAST、ClustalW分析甲壳类食物中该蛋白的氨基酸序列同源性,同时用纯化的21 000过敏原免疫小鼠制备其特异性多克隆抗体,通过该抗体与其他8种甲壳类食物蛋白粗提液的Western blot法结果分析该过敏原的免疫交叉反应。结果:质谱鉴定结果显示,凡纳滨对虾21 000过敏原为肌质钙结合蛋白;氨基酸序列同源性分析显示其与斑节对虾、中国对虾、克氏原螯虾、细趾小龙虾、褐虾的SCP序列一致性为81%～100%;Western blot结果显示,针对SCP的特异性多克隆抗体与凡纳滨对虾、刀额新对虾、斑节对虾、口虾蛄、罗氏沼虾、克氏原螯虾、远海梭子蟹、锈斑鲟、中华绒螯蟹粗提液在SCP对应的21 000左右处均有反应条带。结论:凡纳滨对虾Mr为21 000的次要过敏原为肌质钙结合蛋白,其氨基酸序列与多种甲壳类具有很高的同源性以及较强的免疫交叉反应。

原核表达MurA蛋白并制备其多克隆抗体用于免疫磁珠快速检测单增李斯特菌

【目的】制备MurA多抗,结合免疫磁珠与选择平板进行单增李斯特菌的快速检测,建立单增李斯特菌的免疫磁珠快速检测方法。【方法】构建MurA的原核表达载体,转化大肠杆菌进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,再免疫小鼠,制备其多克隆抗体。用所获多抗制备免疫磁珠,建立单增李斯特菌免疫磁珠-选择性培养基检测方法,并对人工污染牛奶样品进行检测。【结果】在大肠杆菌中高效表达了分子量约为72 kD的可溶性融合蛋白,质谱鉴定其为MurA蛋白;免疫小鼠获得的抗血清效价达1:10 000,与伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆菌及属内其它病原菌均无交叉;所建立的免疫磁珠-选择性培养基检测法可检出浓度为103 CFU/mL及以上的单增李斯特菌,仅与英诺克李斯特菌存在一定交叉反应;牛奶样品单次仅需9 h增菌就能被检出,较常规增菌时间缩短39 h;检测限为0.4 CFU/mL。【结论】表达并纯化得到高纯度的单增李斯特菌MurA蛋白,制备的鼠源多克隆抗体亲和力高,特异性好;建立了快速检测单增李斯特菌的免疫磁珠联合选择性培养基法,在灵敏度不变的情况下,实现24 h内成功对牛奶样品的检测,较国标法减少42 h以上。

虾过敏C57/BL6小鼠动物模型的建立

目的:建立C57/BL6小鼠虾过敏动物模型及其腹腔肥大细胞过敏模型。方法:运用虾蛋白粗提液免疫致敏C57/BL6小鼠,采用Western Blot鉴定致敏小鼠血清中特异性lgE和lgG1抗体;收集小鼠腹腔致敏肥大细胞(PMC),运用虾不同的过敏原组分诱导PMC体外定向释放组胺,HPLC和荧光酶标仪法检测组胺释放水平。结果:Western Blot结果显示致敏小鼠血清IgE和IgG1与相对分子量为36ku的原肌球蛋白反应率分别为57.1%和74.1%,与80ku过敏原的反应率均为42.9%,与21ku过敏原的反应率分别为42.9%和28.6%。HPLC和荧光酶标仪法检测PMC定向释放组胺的结果无显著差异,36ku的原肌球蛋白定向诱导组胺的释放率最高,分别为18.52%和21.59%,80ku和21ku蛋白次之,表明36ku的原肌球蛋白是C57/BL6小鼠的主要虾过敏原,21ku和80ku蛋白是次要过敏原,这与人类虾过敏的状况相一致。结论:C57/BL6小鼠是一种有效的虾过敏动物模型,其腹腔肥大细胞是一种可行的检测和评价食物过敏原的细胞模型。

重组人EGFL6在HEK293细胞中的瞬时表达

旨在通过构建EGFL6的真核表达载体,在HEK293T细胞中进行表达,并利用HEK293T细胞表达的EGFL6条件培养基,探讨EGFL6对人黑色素瘤A375细胞和人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。利用PCR方法亚克隆得到的EGFL6基因片段及EGFP基因片段,用重叠PCR方法构建成EGFP-EGFL6融合基因片段,并分别将测序正确的EGFP-EGFL6融合基因片段及EGFP基因片段构建到真核表达载体pAAV中。表达载体质粒去内毒素纯化后,瞬时转染HEK293T细胞进行表达,荧光定位分析和Western blot检测EGFL6的表达。CCK-8试验分析含EGFP-EGFL6融合蛋白的HEK293T条件培养基对A375细胞和SKOV3细胞的增殖能力的影响。结果显示,酶切鉴定pAAV-EGFP-EGFL6和pAAV-EGFP两个重组表达载体均构建成功;EGFP荧光定位及Western blot结果均显示EGFP-EGFL6在HEK293T细胞中成功表达;增殖抑制试验结果显示EGFL6促进了A375和SKOV3细胞的增殖,对肿瘤细胞的促增殖率分别达到(37.79±14.05)%和(30.53±6.31)%。成功地将EGFP应用于EGFL6真核表达载体的构建与表达,结果表明人EGFL6促进了A375和SKOV3细胞的增殖。

单增李斯特菌InternalinA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆表达单增李斯特菌膜表面蛋白InternalinA(InlA),经免疫家兔获得多克隆抗体,为建立其免疫磁珠富集快速检测方法奠定基础。【方法】利用生物软件设计单增李斯特菌inlA基因的引物,通过PCR扩增出inlA基因,并将其克隆至pET28a()原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。免疫家兔,制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及交叉性,免疫荧光分析多抗与单增李斯特菌菌体结合的特异性。【结果】成功表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量约为92 kD,质谱鉴定其为InlA蛋白;免疫家兔获得的抗血清效价为1:100 000,除与金黄色葡萄球菌约20%的交叉外,与副溶血弧菌等其它病源菌均无交叉;免疫荧光证实该多抗特异性结合于单增李斯特菌膜表面,与同种属的威尔斯李斯特菌不结合。【结论】成功制备了单增李斯特菌特异性的兔多克隆抗体,为单增李斯特菌免疫磁珠富集快速检测方法的建立奠定了基础。

人源性抗bFGF单链抗体表达载体的构建与酵母表达

为了提高人源性抗bFGF抗体的表达量,从噬菌体抗体库筛选出的人源性抗bFGF抗体基因中亚克隆单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)基因,并将其构建到酵母表达载体pPICZαA中。表达载体质粒经线性化后,电转化法转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析和阴离子交换层析纯化,并检测其生物学活性。酶切鉴定结果显示人源性的酵母表达载体构建成功。SDS-PAGE和Western blot结果显示,抗bFGF单链抗体获得了高效表达,表达量可达124mg/L,目的蛋白大小为36 kDa左右。通过两步纯化方案,目的蛋白的纯度可达95%以上。ELISA结果显示纯化的目的蛋白可与bFGF特异性结合。CCK8检测结果显示,纯化的抗bFGF单链抗体可剂量依赖性地抑制人肺腺癌细胞株A549的增殖。研究结果表明在毕赤酵母中可获得人源性抗bFGF单链抗体高效表达,表达产物具有很好的生物学活性。

免疫磁珠富集技术联合选择性培养基快速检测单增李斯特菌

单增李斯特菌是一种危害极大的食源性致病菌，建立快速及特异的检测方法对于食品安全监控尤为重要。丈中联合免疫磁珠与选择性培养基对不同浓度（10^1～10^5CFU／mL）单增李斯特菌进行检测，并对3种李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌进行交叉试验；同时模拟食物污染，探索免疫磁珠．平板法检测样品的检测限以及该方法的最快检测时间。结果显示特异性免疫磁珠联合选择性平板法可检出浓度为10^3 CFU／mL及以上的单增李斯特菌；牛奶样品仅需6h增菌能被检出，检测限为0．7CFU／mL。联合使用免疫磁珠富集技术与选择性培养基，能在30h内完成对牛奶样品的检测，较国标法减少38h以上，且具有同等的灵敏度。

EGFL6基因沉默对人黑素瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的 ：通过特异性小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）抑制人黑素瘤A375细胞中表皮生长因子样结构域蛋白6（epidermal growth factorlike-domain 6,EGFL 6）基因表达,探讨EGFL 6基因沉默对人黑素瘤细胞增殖及侵袭的影响。方法：设计合成靶向EGFL 6基因的siRNA（命名为EGFL6-siRNA）,通过脂质体转染法将该siRNA转染入黑素瘤A375细胞,然后采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测黑素瘤A375细胞中EGFL6 mRNA及蛋白的表达水平,细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法和Transwell实验分别检测A375细胞增殖和侵袭能力的变化。结果：在成功转染EGFL6-siRNA 48 h后,A375细胞中EGFL6 mRNA及蛋白表达水平均明显下降（P值均〈0.01）。EGFL6-siRNA转染组A375细胞在转染后24~72 h各时间点的细胞增殖能力均受到明显抑制（P值均〈0.01）,且细胞侵袭能力显著降低（P〈0.01）。结论：特异性siRNA能够有效地沉默人黑素瘤A375细胞中EGFL 6基因的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。