原位交联含氧化石墨烯的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响

目的制备含氧化石墨烯(GO)的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶并探讨原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响。方法采用实验研究方法。将0.2 mg/mL的GO溶液50μL均匀涂抹于导电胶上,烘干后于场发射扫描电子显微镜下观察GO的结构和大小。将人皮肤成纤维细胞(HSF)分为采用相应终质量浓度GO处理的0μg/mL GO(不加GO溶液,下同)组、0.1μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组、10.0μg/mL GO组,用酶标仪检测细胞培养48 h的吸光度值,以此表示细胞增殖活性(样本数为6)。将HSF和人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)分别分为采用相应终质量浓度GO处理的0μg/mL GO组、0.1μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组,采用划痕试验检测划痕后24、36 h HSF的迁移率(样本数为5)及划痕后12 h HUVEC的迁移率(样本数为3),采用酶联免疫吸附测定法检测培养4、6、8 h后HSF分泌的血管内皮生长因子(VEGF)水平(样本数为3)。将配制的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶设为0μg/mL GO复合水凝胶组、0.1μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组,观察其交联前后的性状,检测用磷酸盐缓冲液浸泡3、7 d后GO的释放情况(样本数为3)。在16只6周龄雌性C57BL/6小鼠背部制作全层皮肤缺损创面,将采用原位交联的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶处理的小鼠按随机数字表法分为0μg/mL GO复合水凝胶组、0.1μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组,每组4只,观察治疗3、7、14 d创面大体情况并计算创面愈合率,采用激光多普勒血流仪检测治疗3、7、14 d创面血流灌注并计算平均灌注单位(MPU)比值,采用苏木精-伊红染色观察治疗7 d创面血管新生情况并计算血管密度(样本数均为3)。取0μg/mL GO复合水凝胶组和0.1μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d的创面组织,采用苏木精-伊红染色观察GO分布与血管新生的关系(样本数为3),行免疫组织化学染色后观察VEGF的表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、Tukey法。结果GO为多层片状结构,宽度约为20μm、长度约为50μm。培养48 h,10.0μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0μg/mL GO组(q=7.64,P<0.01)。划痕后24 h,4组HSF迁移率相近(P>0.05);划痕后36 h,0.1μg/mL GO组HSF迁移率明显高于0μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组(q值分别为7.48、10.81、10.20,P值均<0.01)。划痕后12 h,0.1μg/mL GO组HUVEC迁移率明显高于0μg/mL GO组、1.0μg/mL GO组、5.0μg/mL GO组(q值分别为7.11、8.99、14.92,P值均<0.01),5.0μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0μg/mL GO组和1.0μg/mL GO组(q值分别为7.81、5.33,P<0.05或P<0.01)。培养4、6 h,4组HSF的VEGF表达均相近(P>0.05);培养8 h,0.1μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0μg/mL GO组和5.0μg/mL GO组(q值分别为4.75、4.48,P值均<0.05)。4组GO-GelMA复合水凝胶在交联前均呈红色液体状,交联后呈微黄色凝胶状且流动性无明显差异。0μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶各时间点均无GO释放,其余3组GO-GelMA复合水凝胶中的GO于浸泡3 d部分释放,至浸泡7 d全部释放。治疗3~14 d,4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润,创面逐渐愈合。治疗3、7、14 d,4组小鼠创面愈合率均相近(P>0.05)。治疗3 d,0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值明显高于0μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组(q值分别为10.70、11.83、10.65,P<0.05或P<0.01)。治疗7、14 d,4组小鼠创面MPU比值均相近(P>0.05)。0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d(q=14.38,P<0.05),治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d(q=27.78,P<0.01)。治疗7 d,0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度为每200倍视野下(120.7±4.1)根,明显高于0μg/mL GO复合水凝胶组、1.0μg/mL GO复合水凝胶组、5.0μg/mL GO复合水凝胶组的每200倍视野下(61.7±1.3)、(77.7±10.2)、(99.0±7.9)根(q值分别为12.88、7.79、6.70,P值均<0.01);1.0μg/mL GO复合水凝胶组和5.0μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0μg/mL GO复合水凝胶组(q值分别为5.10、6.19,P<0.05)。治疗7 d,相较于0μg/mL GO复合水凝胶组,0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中成簇新生血管更多,且聚集于GO附近;0.1μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。结论GO质量浓度低于10.0μg/mL对HSF增殖活性无明显影响,0.1μg/mL的GO能够促进HSF和HUVEC迁移,能促进HSF分泌VEGF。原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶敷料能够通过促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生,增加创面早期血流灌注,且GO对新生血管有富集作用,其机制可能与GO促进创面细胞分泌VEGF相关。