斑马鱼prkd1基因在心脏早期发育过程中的作用研究

为了探究蛋白激酶D(protein kinase D,PKD;又名PRKD)家族典型成员prkd1基因对早期心脏发育的影响,选用模式动物斑马鱼为研究对象,设计了吗啉代反义寡核苷酸敲低实验。表型观察结果显示,prkd1基因敲低会导致斑马鱼心脏发育异常,出现心包水肿、环化异常、心管线性化等畸形表型;斑马鱼心率分析数据显示,与野生型斑马鱼相比,prkd1基因的敲低会导致早期斑马鱼心率降低。利用转录组高通量测序技术对受精后3 d(3 days post fertilization,3 dpf)的斑马鱼对照组和敲低prkd1组进行测序,差异基因富集分析表明,prkd1的敲低与心脏相关信号通路如心肌细胞的肾上腺素信号通路等显著相关。进一步通过qRT-PCR对高通量测序结果进行验证,并对早期心脏发育关键因子进行检测,结果显示,部分心血管相关基因显著下调,tbx5a、gata4等心脏调控关键基因同样显著下调。这些表明prkd1基因可能通过调控心脏发育相关信号通路以及心脏发育关键基因来影响早期心脏发育,在早期心脏发育过程中发挥重要作用。

兴奋性hiPSC源性类神经网络组织的构建

【目的】将人诱导多能干细胞源性神经前体细胞(hiPSC-NPCs)种植于去细胞视神经(DON)上,在体外构建一种具有突触传递功能的类神经网络组织,为神经组织损伤的修复提供一种有效途径。【方法】通过定向诱导和组织工程技术,联合应用hiPSCs和3D DON支架,构建一种新的类神经网络组织。定向诱导人诱导多能干细胞(hiPSCs)向人神经前体细胞(hNPCs)及神经元方向分化,使用免疫荧光染色鉴定细胞分化效率。制备3D DON支架,借助扫描电镜、Tunnel染色,鉴定支架形貌及细胞相容性。将诱导的hiPSC-NPCs种植于DON支架中,借助免疫荧光染色、扫描电镜、透射电镜和膜片钳对构建的类神经网络组织进行形态学观察和功能学鉴定。【结果】①免疫细胞化学染色结果提示,诱导的hiPSC-NPCs在体外大部分向神经元方向分化,成功构建了一种以神经元为主的神经网络。②扫描电镜和免疫组织化学结果提示,在体外成功构建了一种以兴奋性神经元为主的类神经网络组织。③免疫组织化学染色、透射电镜和膜片钳结果提示,构建的类神经网络组织能够传递兴奋性突触信息。【结论】利用天然来源的具有均匀孔道分布的DON生物支架材料和hiPSC-NPCs的有机结合,构建了一种以兴奋性神经元为主的具有突触传递功能的类神经网络组织,这种神经网络可作为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)等神经组织损伤后组织替换疗法的有利工具,具有广阔的临床应用前景。

斑马鱼wbp11基因敲除品系的建立

WBP11是WW结构域结合蛋白家族的一员,参与前体mRNA剪接过程,是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一,其基因组中含有人类WBP11的同源基因wbp11。为了研究WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制,利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。首先,在wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点,体外转录合成sgRNA,通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除,得到F0代嵌合体斑马鱼。随后,将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交,所得到的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选出其中的杂合子斑马鱼,并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序,结果显示其为wbp11基因的2种缺失突变。让同种突变的F1代杂合子斑马鱼自交,对得到的后代F2进行基因型鉴定,筛选获得了纯合子斑马鱼,表明wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现,受精后48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形,这可能是由于wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路。

β-氨基丙腈联合血管紧张素Ⅱ构建胸主动脉瘤小鼠模型的研究

目的 探讨通过β-氨基丙腈(beta-aminopropionitrile,BAPN)饮水联合Alzet微孔渗透泵皮下连续释放血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)构建胸主动脉瘤小鼠动物模型的方法。方法 60只3周龄雄性C57BL/6小鼠随机平均分为对照组(20只)、实验A组(20只)及实验B组(20只)。对照组、实验A组和实验B组分别采用普通饮水、0.5 g·kg^(-1)·d^(-1)BAPN饮水和1 g·kg^(-1)·d^(-1)BAPN饮水联合微孔渗透泵(Alzet)皮下连续释放Ang Ⅱ(1μg·kg-1·min-1)。监测各组小鼠饮水量及体质量。分别于第30天和第3天采用超声心动图测量小鼠胸主动脉血管内径并计算直径差,取胸主动脉血管组织行病理学检测,评估胸主动脉瘤小鼠动物模型的构建情况。结果 在建模过程中,实验B组中小鼠体质量增长缓慢甚至不增长;实验B组小鼠胸主动脉血管内径差值(d)为(0.519±0.054)mm,相比于对照组(0.135±0.021)mm和实验A组(0.201±0.043)mm,差异有统计学意义(P<0.05);实验A组和实验B组成瘤率分别为5%和40%。结论 本研究成功构建了胸主动脉瘤小鼠动物模型,操作简便、成本低及成功率高,为胸主动脉瘤机制及诊疗靶点的研究奠定了基础。