转VEGF基因对血管损伤后修复过程中基质金属蛋白酶表达的影响

目的 :观察局部转染血管内皮生长因子 (VEGF)基因对血管球囊拉伤后修复过程中基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子 (TIMPs)表达的影响。方法 :90只新西兰大白兔随机分为 3组 ,Ⅰ组单纯拉伤右髂动脉 ;Ⅱ组拉伤后局部转染真核表达质粒AdtrackCMV ;Ⅲ组拉伤后局部转染pAdtrackCMV -VEGF1 65 ;每组按实验终点随机分为 5个亚组 ,术前一周开始给予高脂饮食至实验终点。取拉伤段髂动脉用于总RNA提取、组织病理和免疫组化检测。结果 :3组动物血脂水平保持在正常的 5 - 1 0倍 ,组间血管损伤程度评分相似 (P >0 .0 5)。Ⅰ、Ⅱ组整个观察过程中均可检测到MMP2、TIMP1 ,2持续表达 ;而转VEGF基因组术后 3d时可检测到MMP1 ,2 ,9、TIMP1 ,2表达 ,1周时达到高峰 ,8周时无表达。结论 :血管损伤后修复过程中存在MMPs和TIMPs表达失衡 ,致使基质堆积 ,并发生病理性重塑 ,而局部转染VEGF基因选择性改变局部MMPs表达 。

转VEGF基因对血管损伤后内皮修复及内皮功能的影响

目的 观察局部转染VEGF基因对血管球囊拉伤后内皮修复及内皮功能的影响.方法 90只新西兰大白兔随机分为3组,Ⅰ组单纯拉右髂动脉;Ⅱ组拉伤后局部转染真核表达质粒Adtrack CMV;Ⅲ组拉伤后局部转染pAdtrack CMV-VEGF 165;每组按实验终点随机分为5个亚组,术前1周开始予高脂饮食至实验终点.喂养至4周的动物处死前20min经耳缘静脉注射5%伊文氏蓝1 mg/kg,取拉伤段髂动脉用于进一步检测.结果 三组动物血脂水平保持在正常的5～10倍,组间血管损伤程度评分相似(P＞0.05).Ⅲ组损伤内皮修复面积明显大于Ⅰ组和Ⅱ组(分别为97.43±8.51 vs 56.89±6.74和61.23±4 95,P＜0.01),内皮依赖性舒张功能明显强于Ⅰ组和Ⅱ组,ec NOS mRNA表达水平明显高于Ⅰ组和Ⅱ组;扫描电镜显示Ⅲ组血管内皮细胞形状规则,接近正常形态,少见血细胞聚积和微血栓形成.结论 局部转染pAdtrack CMV-VEGF 165可有效促进血管损伤后内皮修复和增进内皮功能.

人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达

[目的]为研究canstatin对动脉粥样硬化斑块的稳定作用,克隆人canstatin基因,并在COS7细胞中表达出具有 生物活性的canstatin。[方法]利用RT-PCR技术,从人脐静脉血管内皮细胞中扩增canstatin cDNA,并定向克隆入真核表达载 体pSeeTag2C中。用脂质体转染法,将重组质粒pSecTag2C-canstatin转入COS7细胞。培养48 h后,对转化的COS7细胞行PCR 和Western-blot鉴定,用MTT法检测canstatin对人脐静脉血管内皮细胞增殖的抑制作用。[结果]从人脐静脉血管内皮细胞中 扩增出canstatin cDNA片段。测序结果显示,克隆的canstatin cDNA长684 bp,序列与文献报道一致。从pSecTag2C-canstatin转 化的COS7细胞中能特异地扩增出canstatin基因片段,Westem-blot结果显示,转化的COS7细胞中有特异的34 kDa的 canstatin表达。MTT检测显示,表达canstatin的COS7细胞上清能呈剂量依赖性地抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖。[结论] 构建了真核表达重组质粒pSecTag2C-canstatin,在COS7中表达出具有生物活性的人canstatin。

人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。[方法]用 PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165 cDNA,并定向克隆人原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠 杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖 的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的 VEGF165 cDNA长576 bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致。SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25 ku 的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静 脉血管内皮细胞增殖。[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。

转VEGF基因对血管损伤后平滑肌细胞增殖和表型的影响

目的观察局部转染pAdTrack CMV-VEGF165对动脉粥样硬化兔血管损伤后平滑肌细胞增殖和表型转变的影响.方法90只新西兰大白兔分为3组,Ⅰ组(30只)单纯拉伤腹主动脉;Ⅱ组(30只)拉伤后局部转染真核表达质粒pAdTrack CMV;Ⅲ组(30只)拉伤后局部转染pAdTrackCMV-VEGF165;每组按实验终点(术后3 d、1周、2周、4周和8周)分为5个亚组,术前1周开始予高脂饮食至实验终点,取拉伤段血管用于3H-TdR掺入实验、病理学检测和电镜观察平滑肌细胞表型变化.结果3H-TdR掺人实验结果显示,Ⅰ组和Ⅱ组在血管拉伤后3d3H-TdR掺入量增加(P＜0.05),2周时达到高峰(P＜0.01),以后逐渐下降,8周时恢复至正常,而Ⅲ组血管组织术后3 d同样出现3H-TdR掺入增加(P＜0.05),术后1周时3H-TdR掺入值明显低于Ⅰ组和Ⅱ组(P＜0.01),术后4周时3H-TdR掺入量接近正常;透射电镜观察显示Ⅰ组和Ⅱ组从术后3d开始出现合成型VSMC,2周时达到高峰,80%以上为合成型,至4周时,仍以合成型平滑肌细胞为主(60%),而Ⅲ组血管组织术后3 d时可见少量合成型平滑肌细胞(10%),1周时合成型VSMC约占30%,术后2周时90%为收缩型平滑肌细胞,4周时已无合成型平滑肌细胞.结论局部转染VEGF165基因可抑制平滑肌细胞增殖和表型改变,缩短修复时程.

血管生成素1基因真核表达质粒的构建及测序

目的 :构建血管生成素 1(Ang1)的真核表达质粒psecTagBk -Ang1。方法 :用PCR方法从人心脏文库中扩增Ang1基因全外显子片段 ,并定向插入真核表达载体psecTagBk中 ,用限制性内切酶酶切和测序鉴定克隆的Ang1基因。结果 :扩增出人Ang1cDNA片段 ,测序结果显示扩增的Ang1cDNA包括长为 14 97bp、14 94bp的 2种剪切体 ,分别编码 4 98和 4 97个氨基酸残基。限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒psecTagBk -Ang1。结论 :发现 2种共存的Ang1cDNA剪切体 ,并成功构建真核表达质粒psecTagBk -Ang1。

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-MIF的构建及转化

【目的】构建并转化能在酵母菌AH10 9中表达巨噬细胞游走抑制因子 (MIF)的穿梭表达质粒pGBKT7 MIF。【方法】用RT PCR方法从人T淋巴细胞中扩增MIF基因全外显子片段 ,并定向克隆入细菌 酵母穿梭表达质粒 pGBKT7中 ;用PEG/LiAC法将pGBKT7 MIF转化感受态酵母菌AH10 9。提取转化酵母菌的质粒DNA ,转化大肠杆菌并行质粒的酶切鉴定。【结果】扩增出人MIFcDNA片段 ,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒 pGBKT7 MIF ;获得可在色氨酸缺陷培养基 (SD/ trp)上生长含 pGBKT7 MIF的酵母菌克隆。酶切鉴定表明pGBKT7 MIF已转化入酵母菌AH10 9。【结论】成功构建穿梭质粒 pGBKT7 MIF ,并转化入酵母菌AH10 9。

冠心病患者血清血管内皮生长因子水平与冠状动脉病变程度的关系

目的 :探讨冠心病 (CHD)患者血清血管内皮生长因子 (VEGF)水平与冠状动脉病变的关系。方法 :采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测了 12 4例经冠状动脉造影证实有一支以上主要冠状动脉狭窄≥ 5 0 %的CHD患者血清VEGF水平 ,并作相关分析。结果 :CHD组血清VEGF水平明显高于正常对照组〔(2 93.2± 12 6 .3)ng/L∶(12 0 .1± 31.5 )ng/L ,P <0 .0 1〕 ,双支和三支血管病变患者血清VEGF水平高于单支组〔(2 83.4± 85 .0 )ng/L ,(398.1± 10 5 .5 )ng/L∶ (191.7± 2 7.3)ng/L ,P <0 .0 1〕 ,随着血管狭窄程度的加重 ,血清VEGF水平升高越明显 ,两者呈显著正相关 (r =0 .78,P <0 .0 0 1) ,CHD并发高血压和 (或 )糖尿病对血清VEGF水平无显著影响 (P >0 .0 5 )。结论 :CHD患者血清VEGF水平升高 。

转血管内皮生长因子基因对血管损伤后重塑的影响及机制探讨

目的 观察局部转染pAdtrackCMV VEGF16 5对血管球囊拉伤后重塑的影响并探讨可能机制。方法 90只新西兰大白兔随机分为 3组 ,Ⅰ组 (30只 )单纯拉伤腹主动脉和右髂动脉 ;Ⅱ组 (30只 )拉伤后局部转染真核表达质粒pAdtrackCMV ;Ⅲ组 (30只 )拉伤后局部转染pAdtrackCMV VEGF16 5 ;每组按实验终点 (术后 3d、1周、2周、4周和 8周 )随机分为 5个亚组 ,术前 1周开始给予高脂饮食 ,继以高脂饮食喂养至实验终点。取拉伤段腹主动脉用于总RNA提取 ,拉伤段髂动脉 4%甲醛原位灌注固定后用于组织病理和免疫组织化学检测。结果 3组动物血脂水平保持在正常的 5～ 10倍 ,组间血管损伤程度评分相似 (P >0 0 5 )。术后 2周时 ,Ⅲ组血管内膜加中膜面积明显小于Ⅰ、Ⅱ组 [(0 5 0± 0 32 )mm2 比 (0 94± 0 34 )mm2 、(0 92± 0 43)mm2 ,P <0 0 5 ],4周时Ⅲ组血管外弹力板下围绕面积明显大于Ⅰ、Ⅱ组 [(1 89± 0 31)mm2 比 (1 40± 0 2 0 )mm2 、(1 36± 0 2 1)mm2 ,P <0 0 5 ],狭窄程度明显低于Ⅰ、Ⅱ组 [(11 1± 3 1)mm2 比 (5 4 2± 7 6 )mm2 、(5 7 4± 7 7)mm2 ,P <0 0 1];术后 3d时 ,Ⅲ组血管组织可检测到VEGF16 5、基质金属蛋白酶 (MMP) 1,2 ,9及其组织抑制因子 (TIMP) 1,2表达 ,2周时达高峰 。