沙丁胺醇人工抗原合成及鉴定研究

用琥珀酸酐将沙丁胺醇活化后制备出半抗原沙丁胺醇半琥珀酸,经电喷雾电离质谱(ESI-MS)、红外光谱(IR)和核磁共振(1H-NMR)鉴定合成成功,同时证实琥珀酸酐连结在沙丁胺醇乙醇胺的羟基处,且半抗原以内胺盐形式存在。用混合酸酐、活泼酯方法将沙丁胺醇琥珀半酸分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原,经紫外吸收法鉴定偶联成功,偶联比分别为12.8:1、23:1。本研究为进一步制备沙丁胺醇抗体奠定了基础。

甲胺磷衍生物的合成及人工抗原的制备

O,S-二甲基硫代磷酰氯与β-丙氨酸反应,得到一种甲胺磷的结构衍生物,经薄层层析和1HNMR鉴定,推测预期产物生成。分别采用活泼酯法和混合酸酐法将产物与BSA、OVA偶联制备了人工抗原MZB和MGO,通过紫外光谱鉴定证明偶联成功。用TNBS比色法测定了MZB、MGO与载体蛋白的克分子结合比,分别为16:1和9:1。以MZB为免疫原免疫Balb/c小鼠,以MGO为包被抗原对小鼠血清进行间接竞争ELISA分析表明,小鼠经免疫后产生了针对甲胺磷的特异性抗体,抗血清效价为51:200,从而进一步证明抗原合成成功。本方法简便易行,为研究建立甲胺磷的免疫分析方法奠定了基础。

除草剂丁草胺直接竞争ELISA检测方法研究

制备出3种不同结合比的酶标抗体,对检测条件进行了优化,建立了标记抗体固相抗原直接竞争ELISA(cdELISA)检测丁草胺的方法。结果表明,酶标抗体克分子比为1.55时偶合物活性最高,包被浓度1μg·mL-1,酶标抗体800倍稀释,稀释液采用2×PBS,不含BSA、甲醇,建立的标准曲线IC50=1.7ng·mL-1,检测限为0.006ng·mL-1,检测范围0.06～2616.7ng·mL-1,批内变系数9.25%,批间变异系数23.55%。蒸馏水以及稀释10倍后的矿泉水、池塘水、稻田水添加1ng·mL-1和10ng·mL-1的丁草胺,用所建立的方法检测,平均回收率分别为93.27%、158.50%、119.75%、124.51%。本研究为进一步开发丁草胺免疫分析试剂盒奠定了基础。

高亲和力的农药克百威单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力农药克百威单克隆抗体,建立克百威残留免疫检测方法,控制克百威残留,保障人民身体健康与保护环境。方法合成克百威半抗原BFNB,用人工抗原BFNB-BSA免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,经间接ELISA筛选及显微克隆法亚克隆,分离出阳性细胞株,腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法大量制备及纯化单克隆抗体,间接ELISA法测定抗体滴度及亲和力,间接竞争ELISA法测定抗体特异性。结果获得1株稳定分泌抗克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3,其培养上清和腹水抗体滴度分别为1﹕2.048×103和1:1.024×106,其抗体亚类为IgG1,亲和力常数为2.54×109 L.mol-1,IC50为1.18 ng.ml-1,最低检测限为0.01ng.ml-1。与克百威降解产物呋喃酚的交叉反应率为4.59×10-4%,另外几种结构类似的氨基甲酸酯类农药的交叉反应率均小于3.0×10-4%。结论此抗克百威的单克隆抗体亲合力高、特异性强,为建立克百威简便、快速、特异的免疫检测方法奠定了基础。

抗克伦特罗单链抗体可溶性表达及特性鉴定

目的:表达抗克伦特罗(CBL)可溶性单链抗体(scFv)并进行抗原结合活性鉴定。方法:利用呈现scFv的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导可溶性scFv表达。渗透休克法提取菌体细胞周质腔中scFv。经SDS-PAGE、Western-Blotting以及间接ELISA法分析检测可溶性scFv的表达,并采用间接竞争ELISA法鉴定scFv的抗原结合活性。结果:细菌培养上清及周质腔中均有抗CBL可溶性scFv表达,其分子量约为29kD;上清液及周质腔中scFv效价分别为1:80,1:1600,能够被CBL竞争性抑制,IC50分别为0.78、0.95ng/ml。结论:可溶性抗CBLscFv在大肠杆菌HB2151中获得成功表达,表达的scFv与CBL具有很好的结合活性,可用于进一步建立CBL相应的免疫学检测方法。

丁草胺人工抗原及抗体制备研究

以除草剂丁草胺、巯基丙酸为原料,合成丁草胺半抗原,用氢核磁共振、电喷雾质谱、红外光谱方法进行鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备丁草胺人工抗原,用紫外光谱法对其鉴定;免疫动物后,间接竞争ELISA检测鉴定抗体。结果表明,巯基丙酸与丁草胺连接生成半抗原,半抗原被连接到载体蛋白上,丁草胺人工抗原合成成功,获得了丁草胺小鼠抗血清。棋盘滴定法确定包被抗原工作浓度为3μg/ml,抗血清稀释倍数为32000倍。建立了间接竞争ELISA标准曲线,丁草胺IC50为1.44μg/ml,检测限为0.47μg/ml。

小分子化合物高特异性识别体制备新技术

无论在医学领域还是在食品安全领域小分子化合物的识别与检测已成为目前研究的热点和难点,抗体在识别小分子化合物上还存在许多不足,SELEX技术与Anticalin制备技术的出现为小分子化合物识别带来了希望,本文主要介绍了SELEX技术与Anticalin制备技术的原理特点及其研究进展与应用。

脂质运载蛋白突变文库的应用及研究现状

脂质运载蛋白(lipocalin)蛋白家族是一类广泛存在于生物界、与体内小分子物质运输和贮存相关的蛋白质家族。由于其高级结构具有与抗体高级结构类似的特点:由保守区和超变区组成,因此,以脂质运载蛋白为骨架构建的突变文库也成为一个新的研究领域,该文介绍脂质运载蛋白家族的结构特点、脂质运载蛋白突变文库的应用及研究现状。

除草剂丁草胺人工抗原合成及其抗体制备研究

以除草剂丁草胺、巯基丙酸为原料,合成丁草胺半抗原,用氢核磁共振、电喷雾质谱、红外光谱方法进行鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备丁草胺人工抗原,用紫外扫描法鉴定;免疫动物后,间接竞争ELISA检测鉴定抗体.结果表明,巯基丙酸与丁草胺连接生成半抗原,半抗原被连接到载体蛋白上,抗血清能被丁草胺阻断,丁草胺人工抗原合成成功,获得了抗丁草胺多克隆抗体.

有机磷农药三唑磷半抗原合成与鉴定

以三氯硫磷、苯唑醇、6-氨基己酸为原料,采用三步反应,合成三唑磷半抗原6-[O-乙基-O-（1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3-基）硫代磷酰胺基]己酸,经质谱和1H-NMR鉴定表明合成成功,为进一步制备三唑磷抗体奠定了基础.

抗克伦特罗单链抗体噬菌体展示文库的构建初步筛选及鉴定

构建抗克伦特罗(CBL)单链抗体噬菌体展示文库(scFv phage displaylibraries),从中筛选CBL特异性噬菌体单链抗体(phage scFv).提取经CBL免疫的小鼠的脾脏总RNA,RT-PCR扩增全套抗体轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)基因,重叠延伸法将VL、VH片段拼接为单链抗体(scFv)基因片段.将scFv克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化感受态大肠杆菌TG1,用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,构建噬菌体单链抗体库.对抗体库进行亲合富集后,ELISA法筛选阳性克隆.扩增出抗CBL的VL、VH基因片段并拼接为全长的scFv,抗体库库容约为1.6×104,经4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集,ELISA筛选到6个具有CBL结合活性的phage-scFv.成功构建抗CBL单链抗体噬菌体展示库,并初步筛选到具有CBL结合活性的噬菌体scFv,特异性好,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.

利用SD大鼠抗血清建立瘦肉精ciELISA检测方法的研究

以克伦特罗（CL）为竞争半抗原,人工合成的克伦特罗-卵清白蛋白（CL-OVA）为包被抗原,两者与一定量的SD大鼠抗CL血清反应,建立快速定量测定CL含量的间接竞争酶联免疫吸附检测（ciELISA）方法.结果表明,理想的包被抗原质量浓度为3μg/mL,抗CL血清稀释倍数为1∶1.6×10^5.绘制出标准曲线,线性检测范围为4.88～5 000ng/mL,线性回归方程为y=-0.295 2x＋1.160 6,r^2=0.990 2,加标平均回收率为95.45%.该方法敏感性高,特异性强,操作简便,对于研制瘦肉精残留检测试剂盒有重要意义.

盐酸克伦特罗时间分辨荧光免疫检测方法的建立

采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立快速、高灵敏度的盐酸克伦特罗(CLB)全自动检测方法。以CLB-OVA包被96微孔板作为固相抗原,与游离CLB竞争限量的以Eu3+标记的抗CLB单克隆抗体,建立解离增强模式的荧光免疫分析体系检测CLB。该方法的灵敏度为0.03ng/mL,批内和批间变异系数分别为2.0%和8.9%,平均回收率为105.8%,与沙丁胺醇、莱克多巴胺的交叉反应率分别为0.96%和0.77%,结果表明,用TRFIA法检测CLB,灵敏度高、特异性强、稳定性好,具有良好的应用前景。

氯丙醇检测方法研究进展

氯丙醇类化合物是国际公认的食品污染物,包括3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)、2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD)以及双氯取代的1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)和2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)。文章综述了国内外氯丙醇检测方法的研究进展,包括气相色谱(GC)法、气质联用(GC/MS)法、气相色谱双串联质谱(GC/MS/MS)联用法以及其它新的检测方法。

有机磷农药三唑磷半抗原合成与鉴定

以三氯硫磷、苯唑醇、6-氨基己酸为原料,采用3步反应合成三唑磷半抗原6-[O-乙基-O-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酰胺基]己酸,经质谱和1H-NMR鉴定表明,合成成功,为进一步制备三唑磷抗体奠定了基础。