稀有血型库和血小板供者资料库的研究进展

红细胞稀有血型抗体可引起急性或迟发性输血反应,当患者产生此类抗体时如不能及时得到相应抗原阴性的血液,将危及生命健康。当临床上患者危急需要输注人类白细胞抗原(HLA)、血小板特异性抗原(HPA)配型相合的血小板时,无法及时找到血源库存或供者,可能会耽误临床输血和治疗,甚至造成血液输注无效或者患者死亡等严重后果。血小板输注无效(PTR)的临床标准是指患者两次连续输注足量随机ABO同型血小板或者在两周内3次输用血小板都没有达到预期治疗效果。我国目前是在ABO血型相合的前提下随机输注血小板,即所谓的“盲输”,多次“盲输”会使患者产生血小板抗体从而导致PTR。

深圳市健康无偿献血者外周血淋巴细胞表面人类白细胞抗原-E的基因型特异性表达研究

目的探讨深圳市无偿献血个体的外周血淋巴细胞表面人类白细胞抗原（HLA）-E表达水平，并分析HLA-E基因型与HLA表达水平的相关性。方法采用简单随机抽样法选择2015年8月至10月于深圳市血液中心无偿献血的82例献血者作为研究对象。采用Sepmate淋巴细胞分离管分离82例献血者的外周血淋巴细胞，然后采用流式细胞技术检测淋巴细胞表面HLA-E的表达水平；同时提取研究对象的外周血的DNA，采用PCR-直接测序法（SBT）进行序列测定，判定其HLA-E基因型；并且采用方差分析和t检验的统计学方法，分析比较不同HLA-E基因型献血者外周血淋巴细胞表面HLA-E表达水平的差异。结果本研究82例献血者中，检出的HLA-E＊01：01／＊01：01基因型频率为20．7％（17／82），HLA-E＊01：Ol／＊01：03基因型频率为41．5％（34／82），HLA-E＊01：03／＊01：03基因型频率为37．8％（31／82），3种基因型献血者的外周血淋巴细胞表面HLA_E相对表达水平分别为2．57±0．66、3．32±1．33和3．77±1．26，三者比较，差异有统计学意义（F=6．062，P〈0．05）。其中，HLA-E＊01：03／＊01：03基因型献血者外周血淋巴细胞表面HLA-E相对表达量最高，其次为HLA-E＊01：01／＊01：03基因型献血者，HLA-E＊01：0l／＊01：01基因型献血者外周血淋巴细胞表面HI。A-E相对表达量最低，并且两两比较，差异均有统计学意义（HLA-E；01：03／＊01：03基因型与HI。A_E＊01：01／＊01：03基因型比较，t=2．402，P〈0．05；HLA-E＊01：03／＊01：03基因型与HLA-E＊01：01／＊01：01基因型比较，t=4．212，P〈0．001；HLA-E＊01：Ol／＊01：03基因型与HLA-E＊01：01／＊01：01基因型比较，t=3．054，P〈0．01）。结论深圳市健康献血人群外周血淋巴细胞表面HLA-E表达水平与其基因型密切相关。

深圳地区汉族无偿献血人群Kidd血型系统基因多态性的分子遗传学研究

目的 探讨深圳地区汉族无偿献血人群Kidd血型系统基因多态性的分子遗传学背景.方法 采用简单随机抽样法选择2015年1月至2015年12月于深圳市血液中心无偿献血的74例汉族献血者为研究对象.采用红细胞尿素溶血试验及常规血清学方法鉴定献血者的Kidd血型表型.采用PCR扩增JK基因第4～11外显子及部分内含子片段,并且采用直接测序法对PCR扩增产物进行序列分析.结果 ①74例献血者的Kidd血型表型分别为Jk(a+b+)37例,Jk(a+b-)16例,Jk(a-b+)21例,未筛查出稀有Kidd血型表型Jk(a-b-).②74例献血者的DNA样本均成功扩增JK基因第4～5外显子、第6外显子、第7外显子、第8～9外显子、第10外显子、第11外显子区域.③DNA序列分析结果显示,37例Jk(a+b+)表型献血者DNA样本中,JK基因存在第9外显子c.838G＞A和第7内含子c.664-68C＞T杂合突变.21例Jk(a-b+)表型献血者DNA样本中,JK基因为c.838AA和c.664-68CC纯合型,而16例Jk(a+b-)表型献血者DNA样本中,JK基因为c.838GG和c.664-68TT纯合型.74例献血者DNA样本中,JK基因均为第8内含子c.811+84TT纯合型.结论 深圳地区汉族献血人群Kidd血型系统中,除存在JK基因第9外显子c.838G＞A(p.Asp280Asn)突变以外,还存在第7内含子c.664-68C＞T碱基置换,该突变可能与JKa/JKb基因多态性相关.并且JK基因第8内含子均为c.811+84TT纯合型,其在中国人群中属于常见的基因型.

抗-D抗原决定簇互补区多肽遮蔽RhD抗原的效果

目的建立抗-D抗原决定簇互补区(CDRs)多肽遮蔽Rh D抗原的方法,并对遮蔽效果进行评价。方法根据抗-D CDRs氨基酸残基顺序合成多肽,使用流式细胞术检测红细胞表面Rh D抗原在多肽遮蔽前后的荧光强度;荧光显微镜下观察多肽与Rh D抗原的结合情况;使用在线分析工具对有效多肽进行理化性质及二级结构分析。结果不同多肽对Rh D抗原的遮蔽效果有较大差异,其中3号多肽遮蔽效果较理想,荧光强度显著降低。结论抗-D CDRs多肽可有效遮蔽Rh D抗原。

人类红细胞MN血型中抗-M与GYPA基因表达的相关性

目的研究人类红细胞MN血型系统中抗-M的产生与相关基因GYPA表达的相关性,同时揭示M抗原的表达与抗-M产生之间的关系。方法选择无偿献血者和临床中发现的血浆中含有IgG、IgM或两者共存的16例抗-M血液样本,以血清学及分子生物学方法对样本进行MN血型检测,应用自行设计的一对特异性引物检测MN血型相关基因GYPA第二外显子的碱基序列。结果 16例样本中12例表现型为NN型,2例为MN型,2例为MM型。基因测序结果与GenBank参比序列比对,未发现突变碱基,血型表现型的基因定型与血清学定型相一致,经过谱细胞鉴定,该16例患者的血浆中全部携带抗-M抗体。结论人类红细胞MNS血型中抗-M的产生与M抗原是否存在没有必然关联,与相关基因GYPA的表达也无明显关联。

猪苓多糖对慢性乙型肝炎患者单核细胞源树突状细胞的影响初探

目的探讨猪苓多糖(PPS)对慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单核细胞源树突状细胞(MoDC)的影响。方法从CHB患者外周血中分离出单核细胞(Mo),然后将Mo与GM-CSF、IL-4体外培养9天,并于培养第6天加入PPS共同培养,在倒置显微镜下观察DC的形态,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,用ELISA检测DC培养上清中IL-12p40+p70的含量,并与对照组比较。结果PPS可刺激DC分泌IL-12p40+p70,增强DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论PPS可以增强CHB患者外周血MoDC的免疫功能,提示其可能通过调节DC的功能参与免疫应答。

两种从陈旧血中抽提基因组DNA方法的比较

目的比较盐析法和磁珠法从陈旧血中抽提基因组DNA的效果和特点,以便常规用于骨髓库HLA基因分型。方法使用TECAN全自动工作站为平台,分别用Gentra盐析法DNA抽提试剂盒和Promega磁珠法DNA抽提试剂,从48份陈旧全血样本中抽提基因组DNA,提取的基因组DNA均溶于100μlTE中;然后用紫外分光光度计测定其产量和纯度,并用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA样本的完整性。结果从400μl陈旧全血中提取基因组DNA,用盐析法获得的DNA含量为28.6±8.7ng/μl,A260/A280值平均为1.63±0.209;用磁珠法获得的DNA含量为94.2±10.3ng/μl,A260-A320/A280-A320值平均为1.821±0.102;琼脂糖电泳法检测表明两种方法提取的DNA的分子量均大于15kb。结论使用磁珠法从陈旧血中所获得的DNA的产量和纯度明显高于盐析法,适合于骨髓资料库陈旧血样本的常规HLA基因分型实验以及下游的分子生物学实验。

不同储存时段血小板膜凋亡蛋白表达的变化

目的：分析不同储存时段血小板膜磷脂酰丝氨酸（PS）的表达变化，评价储存期间血小板的质量状况。方法：以凋亡受体Fas（CD95）体外诱导血小板凋亡，建立流式细胞术检测血小板PS的实验方法。测定不同储存时段30份血小板PS的静止表达率，同时检测经CD95刺激的血小板PS的诱导表达率。结果：在0、1、5、7和8d储存时间，静止血小板膜PS表达持续升高，表达率分别为2．03％±0．91％、3．26％±1．86％、8．98％±4．60％、26．68％±21．28％和38．85％±26．43％，各组间比较差异有显著性（P〈0．05～P〈0．001）。在CD95诱导作用下，各储存时间组血小板膜PS诱导表达率明显高于新鲜血小板0d组，组间比较差异有显著性（P〈0．01）。储存7d静止血小板PS表达率与CD95诱导0d组的诱导表达率比较（26．68％±21．28％和25．29％±18．90％）差异无显著性（P〉0．05）。结论：血小板膜凋亡蛋白PS的表达随储存时间延长而显著增加。新鲜血小板有抗凋亡诱导作用。血小板储存至7d，仍可能保持正常功能。

HLA-B位点不合两份脐血混合移植植入状态的动态观察

目的动态观察分析两份HLA不全相合异基因混合脐血移植后的植入状态。方法一例成人急性髓细胞白血病患者采用了两份HLA-B位点不全相合非血缘脐血移植(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg),对其移植前、移植后15天、30天、52天和69天的外周血进行HLA及STR基因两种遗传学标记物的检测。采用PCR-SSP基因分型试剂盒对HLA-B位点进行差异分析,用“ProfilerPlus”及“Cofiler”试剂盒检测15个STR位点,对移植前后的检测结果进行对比分析。结果HLA及STR检测均显示移植后15天、30天基因型为完全两份脐血的嵌合型,移植后52天、69天只表达脐血1的基因型。结论两份脐血移植初期可同时植入,而后其中有核细胞数高的一份脐血可长期植入。HLA及STR基因作为植入证据为临床脐血混合应用及治疗提供了直接的实验依据。

深圳地区汉族献血人群MICA等位基因多态性及其与HLA-B基因的连锁不平衡分析

目的研究主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关基因A位点（major histocompatibility complex class Ⅰ chain-related geneA，MICA）在深圳地区汉族献血人群中的分布特点及其与人类白细胞抗原B位点（human leukocyte antigen locusB，HLA-B）基因的连锁不平衡关系。方法采用基于聚合酶链反应一碱基序列直接测序（PCR-sequence based typing，PCR-SBT）方法对143名随机深圳地区汉族献血者进行MICA和HLA-B基因高分辨分型，并采用Pypop软件分析等位基因频率、单倍型频率和连锁不平衡参数。结果143名献血者标本中共检出了13个MICA和35个HLA-B等位基因，其中MICA＊008：01频率最高（76／286）MICA＊008：01-HLA-B＊40：01和MICA＊010-HLA-B＊46：01是最常见的单倍型。结论获得了深圳地区汉族献血人群MICA和HLA-B基因的等位基因和单倍型多态性及连锁不平衡分析数据，列出了部分MICA和HLA-B等位基因及单倍型频率，为MICA和HLA-B基因的相关研究和应用提供了参考数据。

乙型肝炎病毒相关性肝癌患者HLA-Ⅰ基因多态性分布特征研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝癌(HCC)患者人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类(A、B、C)等位基因多态性分布特征。方法用基于Illumina平台GenDx NGSgo分型方法对101例HCC患者(试验组)和186例健康者(对照组)进行HLA-Ⅰ基因分型,并进行统计学分析。结果与对照组比较,试验组HLA-ⅠB*44:03基因频率(2.97%vs.0.81%)更高,HLA-ⅠA*02:01基因频率(5.45%vs.10.48%)和HLA-ⅠC*03:03基因频率(2.48%vs.6.72%)更低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论携带不同HLA-Ⅰ等位基因与HBV阳性患者发展成为HCC有一定的相关性。

中国汉族人群中KIR3DL1及其配体对宫颈癌的保护性作用及机制探讨

目的探讨中国汉族人群抑制性KIR(inhibitory KIR,iKIR)受体及其HLA配体在宫颈癌发生发展中的作用及其机制.方法随机采集265例宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌患者及200名正常女性的外周血样本,应用特异性PCR扩增、反向序列特异性寡核苷酸探针、序列分型方法以及TCGA数据库的宫颈癌数据,分别分析iKIR基因及其受配体基因组合、肿瘤组织iKIR转录水平、KIR3DL1等位基因与宫颈癌发生发展的相关性.结果在4种iKIR基因(KIR2DL1、2DL2/3、3DL1和3DL2)中,正常人群KIR3DL1基因和KIR3DL1+HLA-Bw4基因组合的检出频率均显著高于宫颈癌患者(96.5%vs.87.0%、81.5%vs.64.8%),差异有统计学意义(P=0.018,P=0.009);肿瘤组织KIR3DL1高转录水平的富颈癌患者生存率显著高于KIR3DL1低/中转录水平的宫颈癌患者,差异有统计学意义(P=0.028);正常人群强抑制性高表达型KIR3DL1*01502等位基因的检出频率显著高于宫颈癌患者(76.0%vs.59.3%),差异有统计学意义(P=0.015).结论汉族人群中KIR3DL1及其受-配体组合对拮抗宫颈癌发生发展具有保护性作用,其保护作用可能与强抑制性高表达型KIR3DL1*01502等位基因有关.

南方汉族KIR-HLA系统分子遗传多态性与急性白血病的相关性

目的探讨中国南方汉族人群KIR-HLA系统分子遗传多态性与急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)的相关性。方法对323份成年ALL、350份成年AML患者以及745份随机健康对照的样本,采用PCR-序列特异性引物(sequence specific primer,SSP)方法检测KIR基因,采用测序分型法进行HLA-A、-B、-C基因分型。从KIR基因、KIR基因组合型、HLAⅠ类配体、已知的KIR+HLA受-配体组合等4个方面比较各病例组与对照组分子遗传多态性的差异。结果ALL及AML病例组中分别检出了32种、33种KIR基因组合型,与对照组中检出的35种KIR基因组合型相比,AA1在ALL组和AML组的检出频率均显著低于健康对照组(ALL组:45.79%vs.55.30%,P_(c)=0.004;AML组:48.27%vs.55.30%,P_(c)=0.030),为急性白血病保护性因素;ALL组中2DL2及其受-配体组合2DL2+HLA-C1、2DS2及其受-配体组合2DS2+HLA-C1的检出频率均显著高于健康对照组,而2DL3基因、HLA-A3/A11配体及3DL2+HLA-A3/A11受-配体组合的检出频率均显著低于健康对照组(P<0.05),但经过Bonferroni校正后差异显著性均丢失(P_(c)>0.05);AML组2DS1和2DL5的检出频率均显著高于健康对照组,而HLA-C2配体及2DL1+HLA-C2受-配体组合的检出频率均显著低于健康对照组(P<0.05),但经过Bonferroni校正后差异显著性均丢失(P_(c)>0.05)。结论本文获得了南方汉族KIR-HLA系统中与急性白血病相关的潜在易感或保护性因素,尤其是保护性因素AA1基因组合型,可为急性白血病发病机制和个体化免疫治疗提供新的线索及理论依据。

中国南方汉族造血干细胞捐献者HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1高分辨等位基因多态性分析

目的探讨中国南方汉族造血干细胞捐献者人类白细胞抗原(HLA)-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点高分辨等位基因的多态性分布。方法选择2016年1月至2017年12月于中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)深圳分库登记的4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者为研究对象。采用PCR-序列特异性寡核苷酸探针(SSO)和二代测序(NGS)技术对本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点进行高分辨等位基因分型检测。采用直接计数法分别计算上述5个HLA位点的常见、确认及罕见等位基因频率。采用χ2检验判断研究对象的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1各位点等位基因的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。结果①本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点等位基因观察值与期望值分别比较,差异均无统计学意义(χ^2=295.068、572.482、355.205、362.584、312.150,P>0.05)。本研究4 262例造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQBl位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。②本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者中,检出的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的等位基因分别为49、97、37、48和22种,其中等位基因频率>0.05的常见等位基因包括:HLA-A*11∶01、24∶02、02∶07、02∶01、33∶03和02∶03,累计等位基因频率为0.767 1;HLA-B*40∶01、46∶01、58∶01、13∶01和51∶01,累计等位基因频率为0.471 6;HLA-C*01∶02、07∶02、03∶04、08∶01、03∶02、06∶02和03∶03,累计等位基因频率为0.782 5;HLA-DRB1*09∶01、15∶01、12∶02、07∶01、08∶03、03∶01、11∶01和04∶05,累计等位基因频率为0.656 4;以及HLA-DQB1*03∶01、03∶03、06∶01、05∶02、03∶02、02∶01、05∶03、06∶02和02∶02,累计等位基因频率为0.877 6。③本研究4 262例中国南方汉族造血干细胞捐献者中,HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的确认及罕见等位基因分别检出22、42、14、11和7种,其中HLA-A*29∶03,HLA-B*18∶04、15∶296和54∶03,HLA-C*12∶12、HLA-DRB1*04∶101,以及HLA-DQB1*02∶10为罕见等位基因,目前尚未被收录于CMDP的《常见及确认等位基因表(CWD)》2.3版本。结论本研究获得较为完整的中国南方汉族造血干细胞捐献者的HLA-A、-B、-C、-DRB1及-DQB1位点的高分辨等位基因多态性分布数据,记录并统计HLA确认及罕见等位基因。本研究结果有助于CMDP中HLA基因人群分布和多态性数据的积累,并且为完善CMDP的CWD提供参考依据。