马氏珠母贝Perlucin基因序列特征及其SNP与耐低温性状的关系

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)新的凝集素分子基因,命名为Perlucin,研究在低温胁迫下马氏珠母贝Perlucin的表达以及与抗低温性状相关的单核苷酸多态性(SNP)位点。【方法】根据马氏珠母贝基因组中Perlucin基因序列设计引物,克隆Perlucin基因全长;用生物信息学方法分析Perlucin的结构和理化特征;设计17和22℃(对照)2个温度组,对马氏珠母贝进行低温胁迫实验,用实时荧光定量PCR检测低温胁迫下Perlucin表达量的变化;筛选和比较分析马氏珠母贝耐低温选育系(R)F3和北部湾野生群体(W)的Perlucin外显子区的SNP位点和单倍型。【结果】马氏珠母贝Perlucin全长631 bp,编码152个氨基酸;包含1个信号肽和1个C型凝集素结构域。同源分析表明,马氏珠母贝Perlucin与紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)Perlucin的亲缘性最近。Perlucin在鳃中表达量最高,其次为足和肝胰腺。低温胁迫时,鳃组织中Perlucin基因在17℃低温组的表达量呈先升高后降低的趋势,在12 h时达到最高并显著高于22℃对照组(P<0.05),表明Perlucin可能参与马氏珠母贝的低温响应过程。对Perlucin外显子区的SNP进行分析,共得到30个SNP,其中13个SNP位点的基因型频率在R和W群体间差异显著(P<0.05)。【结论】Perlucin是参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,筛选出两个SNP位点g.40078856、g.40078945。

急性低氧胁迫对马氏珠母贝生长、免疫及矿化相关基因表达的影响

【目的】探究急性低氧胁迫对马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)生长、免疫及矿化相关基因表达的影响,为马氏珠母贝抗逆品系选育提供参考。【方法】将马氏珠母贝从常氧条件下移至2 mg·L^(-1)低溶解氧水体,比较其在低氧胁迫0、12、24和48 h时免疫与抗氧化相关基因(caspase-3、HSP90、CAT和SOD)、生长相关基因(EGFR、FGF18、OSR1和tgfbr1)和矿化相关基因(pif177、aspein、nacrein和TIMP)的表达水平。【结果】急性低氧胁迫后,HSP90的表达水平12 h时低于对照组(P <0.05),caspase-3和CAT的表达在胁迫24 h时显著增加(P <0.05),而SOD的表达无明显变化(P> 0.05);矿化相关基因pif177、aspein、nacrein在急性低氧胁迫后的表达均显著降低,TIMP仅在12 h时显著降低(P <0.05);生长相关基因EGFR、FGF18和OSR1基因的表达也出现显著下降(P <0.05),tgfbr1的表达在24 h时显著高于对照组(P <0.05)。【结论】急性低氧胁迫上调免疫与抗氧化相关基因中caspase-3、CAT的表达,抑制HSP90的表达,抑制矿化相关基因的表达,抑制生长相关基因中EGFR、FGF18和OSR1的表达,上调tgfbr1的表达。

马氏珠母贝V-ATPase-d基因序列特征及其与耐低温性状的关系

液泡ATP酶(V-ATPase)在生物应对各种环境压力时发挥重要功能,为探究VATPase在马氏珠母贝低温适应过程中的作用,实验克隆了马氏珠母贝的V-ATPase-d基因,采用qRT-PCR技术研究了低温胁迫下Pm-V-ATPase-d表达量的变化,并筛选和比较了该基因在耐低温选育系(low temperature resistant line,R)F_(3)和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-V-ATPase-d总长为1473 bp,开放阅读框(ORF)为1140bp,编码379个氨基酸,具有ATP典型的结构域PfamvATPsynt_AC39。Motif分析及三级结构预测结果表明,Pm-V-ATPase-d具有较高的保守性,其在系统进化树中与长牡蛎聚为一支。组织荧光定量结果显示,Pm-V-ATPase-d在所检测的组织中均有表达,在肝胰腺、性腺和鳃组织中表达量较高。在低温胁迫条件下,Pm-VATPase-d基因的表达量随着时间的延长呈现先上升后下降的趋势,且低温组的表达量在5 d内均显著高于对照组,这表明Pm-V-ATPase-d可能参与了马氏珠母贝对温度胁迫的响应;对Pm-V-ATPase-d外显子区的SNP分析共得到35个SNP,其中34个为同义突变,只有一个位点为非同义突变,26个SNP在W和R群体的不同基因型和等位基因之间具有显著差异,单倍型连锁不平衡分析结果显示,Pm-V-ATPase-d基因SNPs可形成6个单倍体块,14种单倍型,其中单倍型GAAT、CGC、TC、TG、AG与马氏珠母贝耐低温性状显著相关。研究表明,Pm-V-ATPase-d可能是参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,本研究可为马氏珠母贝对低温的适应机制提供研究基础,筛选出的与抗低温性状相关的SNPs及单倍型可应用于分子辅助育种。

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因(CatB)在大珠母贝(Pinctada maxima)不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜(套膜区、边缘膜区和中央膜区)、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框(ORF)1026 bp,5'非编码区(5'-UTR)长度81 bp,3'非编码区(3'-UTR)长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点(pI)为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数(GRAVY)为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝(P.fucata martensii)CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列(ADX32985.1)的相似性高达90.91%;与长牡蛎(Crassostrea gigas,XP_011428258.1)、海湾扇贝(Argopecten irradians,ANG56311.1)、褶纹冠蚌(Cristaria plicata,AEF32260.1)的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05),其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。

大珠母贝胰岛素相关肽受体基因的克隆与表达

【目的】克隆大珠母贝(Pinctada maxima)胰岛素相关肽受体PmIRR基因,并分析其在不同组织中的表达。【方法】利用c DNA快速末端克隆技术(RACE)获得大珠母贝PmIRR基因cDNA全长序列。荧光定量PCR技术分析PmIRR在闭壳肌、鳃、外套膜边缘区、套膜区、中央区、足和肝胰腺等组织的表达模式。【结果与结论】PmIRR基因全长6 009 bp,5′非编码区(UTR)615 bp、3′UTR 764 bp、开放阅读框(ORF)长4 629 bp、编码1 542个氨基酸。序列分析表明,PmIRR含有保守结构域Fu、3个FNⅢ结构域和Tyrkc结构域,并含有信号肽和2个跨膜结构域。PmIRR在大珠母贝各个组织存在差异表达,在鳃、肝胰腺和外套膜边缘区中显著高表达。

马氏珠母贝CD-MPR基因序列特征及其在耐低温品系的选择分析

【目的】明确马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CD-MPR)基因(PmCD-MPR)多态性与其低温耐受能力的相关性,为马氏珠母贝耐低温品系的选育提供理论依据。【方法】采用RACE克隆PmCD-MPR基因序列全长,并运用实时荧光定量PCR检测PmCD-MPR基因在马氏珠母贝各组织及低温胁迫下的表达模式;基于马氏珠母贝耐低温选育系(R群体)和北部湾野生群体(W群体)的全基因组重测序数据筛选出PmCD-MPR基因外显子区的SNP位点,并通过遗传多态性分析、单倍型分析及频率计算获取与马氏珠母贝低温胁迫过程相关的SNP位点。【结果】PmCD-MPR基因序列全长902 bp,其开放阅读框(ORF)为792 bp,共编码263个氨基酸残基;PmCD-MPR基因编码蛋白分子量为30.22 kD,理论等电点(pI)为5.79,属于亲水性蛋白,在第18~263位氨基酸处含有1个典型的甘露糖-6-磷酸受体(Man-6-P_recep)结构域。CD-MPR氨基酸序列在N端的相似性较低,在C端的相似性较高;基于CD-MPR氨基酸相似性构建的系统发育进化树显示,马氏珠母贝与长牡蛎、加利福尼亚海兔等软体动物聚为一支,与经典的动物学分类相吻合。PmCD-MPR基因在马氏珠母贝肝胰腺的相对表达量最高,显著高于在性腺、闭壳肌和外套膜中的相对表达量(P<0.05,下同);低温胁迫组马氏珠母贝鳃组织中的PmCD-MPR基因相对表达量随着胁迫时间的延长整体上呈先上升后下降的变化趋势。从PmCD-MPR基因外显子区筛选获得34个SNPs位点,且这34个SNPs位点构成5个单倍块和15种单倍型,其中GCC、TG、CCCTCT等3种单倍型在R群体中的分布频率显著高于W群体,即与马氏珠母贝耐低温性状显著相关。【结论】PmCD-MPR基因参与马氏珠母贝的低温响应过程,与耐低温性状显著相关的基因型及单倍型可作为马氏珠母贝耐低温品系辅助育种的候选分子标记。

马氏珠母贝α-Tubulin基因结构、SNP筛选及耐低温相关性分析

为了探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)α-Tubulin基因在低温适应性中的作用,通过RACE克隆技术获得马氏珠母贝α-Tubulin基因,分析了α-Tubulin基因在低温胁迫下的表达趋势,并筛选和比较了马氏珠母贝耐低温选育系(R)F3和北部湾野生群体(W)的α-Tubulin编码区SNP位点。结果表明:马氏珠母贝α-Tubulin基因总长为2107 bp,可编码454个氨基酸,具有典型的Tubulin和Tubulin-C结构域;全组织定量显示,α-Tubulin基因在所有组织中均有表达,在足部中表达量最高(P<0.05);低温胁迫时,鳃组织中α-Tubulin基因在低温组(12、17℃)的表达量均在72 h时达到最高,且显著高于对照组(22℃)(P<0.05);α-Tubulin外显子区域共有34个SNP,其中3个SNP位点的基因型频率在R和W群体间有显著性差异(P<0.05);连锁不平衡分析显示,R群体单倍型CCTCAGCGCC的频率明显高于W群体。研究表明,α-Tubulin为参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,筛选出的与抗低温性状相关的SNP位点g.111071125及优异单倍型CCTCAGCGCC,可作为选择育种的候选标记。

马氏珠母贝Rab7基因序列特征及其与耐低温性状的关系

Rab蛋白是膜泡运输过程中的重要调节因子,在囊泡运输和水产动物的免疫应答中行使重要功能。本研究鉴定了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的Rab7基因(Pm-Rab7),分析了Pm-Rab7在6个组织中及在温度胁迫(低温组17℃、对照组22℃、高温组32℃)下的表达模式,筛选和比较分析了马氏珠母贝耐低温选育系(low temperature resistant line,R) F3和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)的Pm-Rab7外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-Rab7序列全长为1 153 bp,5′端、3′端和开放阅读框(ORF)序列长度分别为30、505和618 bp,共编码205个氨基酸;Pm-Rab7具有一个RAB保守结构域,并与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)相似度最高(92.79%)。系统进化树结果显示,Pm-Rab7与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支。Pm-Rab7在所检测的组织都有表达,其中在性腺和鳃中的表达显著高于外套膜和肝胰腺等组织(P<0.05)。Pm-Rab7温度胁迫后时序表达分析发现,在17℃低温组,Pm-Rab7的表达量呈先上升再下降的趋势,在6 h~3 d内均显著高于22℃对照组(P<0.05),在1 d时达到峰值;在32℃高温组,Pm-Rab7表达量总体稳定,仅12 h时显著高于对照组(P<0.05),其他时间点与对照组无显著差异(P>0.05);说明该基因的表达与马氏珠母贝对低温胁迫的响应密切相关。Pm-Rab7基因的外显子区域在马氏珠母贝耐低温选育系和北部湾野生群体中共检测到7个SNP位点,其中3个位点的基因型频率在2个群体间具有显著性差异,说明这些位点可能与其耐低温性状相关。结果表明,Pm-Rab7可能在马氏珠母贝耐低温适应过程中发挥重要作用,研究结果可为深入探讨马氏珠母贝对温度变化的环境适应性研究提供参考资料。

马氏珠母贝PEPCK基因序列特征及其在耐低温品系的选择印记分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)是糖异生途径的关键酶,当动植物处于温度胁迫等不良环境条件时,它可通过催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,继而生成葡萄糖以维持机体的血糖平衡,在抗逆过程中起着重要作用。本研究鉴定了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的PEPCK基因(Pm PEPCK),分析了低温胁迫下Pm PEPCK表达量的变化,筛选和比较分析了马氏珠母贝耐低温选育系(low temperature resistant line,R)F3和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)的Pm PEPCK外显子区的SNP位点。序列分析表明,Pm PEPCK基因全长2557 bp,5’UTR和3’UTR分别为56 bp和446 bp,开放阅读框2055 bp,编码684个氨基酸。Pm PEPCK在所检测组织中均有表达,其中肝胰腺表达量最高(P<0.05)。低温胁迫后鳃组织中的时序表达结果显示,低温组(12℃、17℃)Pm PEPCK的表达量在6 h达到最高,显著高于22℃对照组(P<0.05),说明Pm PEPCK参与贝体的低温响应过程。对Pm PEPCK的外显子区SNP进行分析,共得到108个SNP,其中47个SNP位点的基因型频率在R和W群体间差异显著(P<0.05),仅在R中被检测到的基因型有11个,分别是位点g.60010420、g.60007411、g.60011365的基因型AG,位点g.60006265、g.60006166的基因型AA,位点g.60007389、g.60011387的基因型CT和g.60009449、g.60006028的基因型TT,位点g.60011341的基因型GG和g.60009464的基因型GT。结论认为经过3代选育后,R群体的Pm PEPCK基因受到了强烈的正选择,Pm PEPCK的这些SNPs及其基因型可能与选育系的低温耐受能力相关,并可能作为选择育种的候选标记。

马氏珠母贝黑壳色选育系F5和对照群体生产性状的比较

以贝壳棱柱层放射肋条纹颜色与生长性状为育种目标,结合家系选择与群体选择培育了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)黑色放射肋选育品系(简称黑壳色系,black shell color line,BF)。为了探究黑壳色系的生产性能,本研究比较了选育系F5(BF5)和对照群体(control group,CG)在不同生长阶段的多项生产性能指标,包括受精率、孵化率、变态率、生长性状、对低温和高盐的耐受性以及育珠性能。结果显示BF5群体的受精率、孵化率、幼虫第10天和第20天的存活率以及变态率均大于CG群体,差异不显著(P>0.05);在20日龄以后,BF5群体的平均壳长均显著大于CG群体(P<0.05),其中BF5群体240日龄、330日龄和600日龄的平均壳长分别比CG群体提高了17.47%、21.34%和20.28%。33℃高温胁迫30 d后,BF5和CG群体的存活率分别为84.4%和63.9%,差异显著(P<0.05);16‰低盐胁迫30 d后,BF5和CG群体的存活率分别为69.2%和56.7%,群体间差异显著(P<0.05)。植核后150 d至育珠期结束(270 d),BF5的存活率显著高于CG群体(P<0.05),BF5最终存活率比CG提高了18.92%;BF5和CG的商品珠率和优质珠率差异不显著(P>0.05);BF5的留核率、珍珠层厚度显著高于CG(P<0.05),提高率分别达到18.97%和22.61%,表明BF5具有更好的育珠性能。本研究表明,BF5具有更好的生长、抗逆和育珠性能,为马氏珠母贝育种和产业应用提供了基础数据。

马氏珠母贝Pfm-miR-9b-5p序列特征和功能分析

miRNAs可通过靶向目标基因3′UTR,负调控目的基因的表达。本研究以马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的一种miRNA Pfm-miR-9b-5p成熟序列及其基因组数据为基础,获得Pfm-miR-9b-5p前体序列,其长度为99 bp,包含典型的发夹结构。多序列比对结果表明,Pfm-miR-9b-5p的成熟序列和前体序列均与其他物种高度保守。系统进化树分析结果表明,Pfm-miR-9b-5p的前体序列与软体动物聚为一支,与帽贝(Lottia gigantean)亲缘关系最近。组织差异表达分析表明,Pfm-miR-9b-5p在矿化器官边缘膜和套膜区高表达。靶标预测结果表明,贝壳基质蛋白基因PNU9为Pfm-miR-9b-5p的潜在靶标基因之一。注射Pfm-miR-9b-5p mimics过表达Pfm-miR-9b-5p后,靶标基因PNU9的表达被显著抑制,并且贝壳珍珠层和棱柱层均出现异常生长。综上,在马氏珠母贝中,Pfm-miR-9b-5p可通过负向调控矿化基因PNU9的表达,参与贝壳的形成。本研究为进一步探讨miRNAs参与贝壳形成的机制提供了参考。