不同途径移植人脐带间充质干细胞对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤修复研究

目的探讨不同途径移植人脐带间充质干细胞(HU-MSCs)对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)的修复效果。方法将40只雄性SD大鼠随机分为A组(对照组)、B组(模型组)、C组(门静脉移植干细胞组)、D组(尾静脉移植干细胞组),每组10只,B、C、D组采用Pringle法建立HIRI模型,其中B组不予进行干细胞移植,C组和D组分别经门静脉、尾静脉移植氯甲基苯甲酰氨(CM-DiL)标记的HU-MSCs 106个。分别于术前、移植后第1、3、5日抽血检测丙氨酸转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;移植后第5日处死各组大鼠,肝脏取材行苏木素-伊红(HE)及dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色观察肝脏损伤情况,在激光共聚焦显微镜下观察HU-MSCs在各组大鼠肝脏分布情况。结果干细胞移植后C、D组ALT水平较B组降低,且C组ALT水平低于D组(均为P<0.05);C、D组炎症因子TNF-α水平明显低于B组,且与D组相比,C组下降更显著(均为P<0.05)。肝组织HE染色提示B组肝脏损伤最严重,C组肝脏损伤轻于D组。肝组织TUNEL染色结果显示,C、D组的凋亡指数(AI)低于B组,且C组较D组低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。激光共聚焦显微镜下可见,移植后C组与D组均可见CM-DiL标记的HU-MSCs,且C组的HU-MSCs数量高于D组(P<0.05)。结论移植HU-MSCs能减轻HIRI,且门静脉移植效果优于尾静脉移植效果。

化合物BAM15减轻大鼠原代肝细胞冷保存损伤的实验研究

目的探讨化合物BAM15对大鼠离体肝脏原代细胞冷保存损伤的影响。方法采用胶原酶灌注法提取大鼠肝脏原代细胞,根据细胞培养条件的不同,将细胞分为4组:A组(含250 nmol/L BAM15的Hibernate细胞培养液);B组(含500 nmol/L BAM15的Hibernate细胞培养液);C组(含1 000 nmol/L BAM15的Hibernate细胞培养液);对照组(Hibernate细胞培养液)。各组细胞均冷保存12 h。荧光显微镜下观察肝脏原代细胞的纯度。同时测定各组细胞的增殖能力、凋亡情况以及线粒体活性氧(ROS)变化情况。结果 B组和C组的细胞增殖能力均强于对照组(均为P<0.05)。A、B、C组的细胞凋亡率分别为(33.7±2.2)%、(19.7±1.1)%、(28.7±1.2)%,均明显低于对照组[(82.7±4.2)%,均为P<0.05]。A、B、C组的细胞内ROS阳性率分别为(11.8±4.0)%、(7.6±1.3)%、(8.9±1.6)%,均明显低于对照组[(27.4±4.5)%,均为P<0.05]。结论化合物BAM15能有效减轻大鼠肝脏原代细胞的冷损伤,其保护机制可能与BAM15减少冷缺血期间ROS生成有关。

第九届羊城肝脏移植高峰论坛会议纪要

第九届羊城肝脏移植高峰论坛于2017年2月8日至9日在春意盎然的羊城广州隆重召开。本次论坛由中山大学附属第三医院、中山大学器官移植研究所、广东省器官移植研究中心、广东省医师协会器官移植医师分会、广东省肝脏疾病重点实验室共同举办。羊城肝脏移植高峰论坛自2004年起已经成功举办了九届,本届论坛以"移植与免疫"为主题。聚焦近年来在临床免疫耐受、长期免疫治疗对器官移植受体的影响、移植免疫研究体系的建立等热点问题,并对"加速康复外科优化重型肝炎肝脏移植围手术期管理的临床实践"形成了专家共识,顺利召开了中国医师协会器官移植医师分会移植免疫学专业委员会成立大会和《器官移植》杂志2016年总结会,会议取得圆满成功。

慢性乙型肝炎病毒母婴阻断的研究现状与争议

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个全球性的健康问题,母婴传播是HBV慢性感染的最主要原因.即使经正规的主、被动联合免疫,极大地减少了HBV垂直传播,但乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)阳性孕妇的新生儿仍有8%-10%会发生慢性感染.研究显示,母体血清高HBV DNA水平和HBeAg阳性可能与HBV垂直传播有关,而阻断HBV母婴传播的问题也一直是临床医师必须面对和亟待解决的实际问题,但针对乙型肝炎孕妇的抗病毒治疗指征、药物选择、服药开始与停止的时间、产后哺乳等相关问题,目前仍然存在很大的争议.本文将针对HBV母婴阻断的国内外研究现状及存在的争议作一综述以供参考.

15-PGDH表达水平与肝癌肝移植临床预后关系研究

目的探讨15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)表达水平与肝细胞癌(肝癌)肝移植临床预后的关系。方法回顾性分析行肝癌肝移植术的94例受者临床资料。用免疫组织化学法检测所有受者病理组织切片中15-PGDH表达情况;分析15-PGDH蛋白表达水平与肝癌患者各项临床参数的关系;计算肝癌肝移植受者术后5年的无瘤生存率和总生存率;分析可能影响肝癌肝移植受者预后的独立危险因素。结果15-PGDH的表达水平与受者的年龄、Child-Pugh分级和术前甲胎蛋白(AFP)水平相关(均为P<0.05)。15-PGDH低表达组受者的无瘤生存率和总生存率均显著低于15-PGDH高表达组受者(均为P<0.05)。15-PGDH表达水平、肿瘤分化程度、美国癌症联合会(AJCC)分期是影响肝癌肝移植受者预后的独立危险因素(均为P<0.05)。结论15-PGDH表达水平是影响肝癌肝移植受者预后的独立危险因素。

超高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠纹状体中多巴胺及其代谢物的含量

提出了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定小鼠纹状体中多巴胺(DA)及其代谢物高原儿茶酸(DOPAC)与高香草酸(HVA)含量的方法。取小鼠纹状体约10 mg,用200μL 2%(体积分数)甲酸溶液提取、离心。取上清液80μL,加入40μg·L^(-1)异丙肾上腺素(内标)溶液10μL和含0.1%(体积分数,下同)乙酸的甲醇溶液10μL,涡旋混匀,再加入100μL甲醇,涡旋、离心。上清液中DA及其代谢物在Gemini NX-C_(18)色谱柱上分离,以不同体积比的0.1%乙酸溶液和含0.1%乙酸的甲醇溶液混合液为流动相进行梯度洗脱,质谱分析采用电喷雾离子源正、负离子模式,选择反应监测(SRM)模式扫描。结果表明,3种目标物在7.00 min内能完成测定。DA、DOPAC和HVA标准曲线的线性范围分别为0.05~100,0.5~1000,0.25~500μg·L^(-1),检出限分别为0.015,0.150,0.075μg·L^(-1)。按照标准加入法进行回收试验,回收率为84.4%~117%,日内精密度和日间精密度试验所得测定值的相对标准偏差均小于15%。质控样品在自动进样器中保存8 h、4℃保存24 h以及-80℃保存30 d前后3种目标物测定值的相对误差绝对值不大于20%,说明样品稳定性良好。

Zwint高表达对肝癌细胞增殖和肝癌肝移植预后的影响

目的探讨Zw10结合因子(Zwint)在原发性肝癌(肝癌)中的表达情况及其对肝癌肝移植预后的影响。方法收集50例肝癌肝移植受体的肝癌组织、癌旁组织及临床资料。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)法和免疫组织化学(免疫组化)法,分别比较20例肝癌肝移植受体的20对肝癌组织及癌旁组织中Zwint信使核糖核酸(m RNA)表达情况和Zwint蛋白的表达水平;选取两个成功干扰Zwint表达的肝癌细胞系Hep G-2(si-Zwint-1组和si-Zwint-2组),以空白对照作为si-NC组,采用细胞计数试剂盒(CCK)-8实验、平板克隆实验和细胞周期实验,比较各组细胞的增殖能力和细胞周期;采用Western Blot法和免疫组化法,分析肝癌组织和肝癌细胞中Zwint与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的一致性;以Zwint蛋白表达水平的中位数为分割点,将入组病例分高表达组(22例)和低表达组(28例),分析Zwint蛋白表达水平与肝癌肝移植受体临床特征、总体存活率及无复发存活率的关系。结果实时荧光定量PCR结果提示肝癌组织中Zwint m RNA表达水平高于癌旁组织(P=0.03)。Western Blot及免疫组化结果均提示肝癌组织中Zwint蛋白的表达水平高于癌旁组织(均为P<0.05)。干扰肝癌细胞系Hep G-2的Zwint基因后,CCK-8及平板克隆实验显示细胞增殖能力明显减弱(均为P<0.01),细胞周期阻滞于G1期(均为P<0.05)。Zwint蛋白表达水平与肿瘤直径和肿瘤、淋巴、转移(TNM)分期密切相关(均为P<0.05)。Zwint高表达组肝癌肝移植受体的总体存活率低于低表达组(P=0.02)。结论 Zwint高表达于肝癌组织,其通过调节细胞周期促进肝癌细胞增殖,且Zwint表达水平与肝癌肝移植后预后呈负相关。

慢性乙型肝炎患者PBMCs中ROG、GATA3和T-bet mRNA水平及其意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中转录因子ROG、GATA3和T-bet m RNA水平变化及意义。方法收集135例慢性乙型肝炎患者(轻度45例、中度42例、重度48例)和15例健康志愿者(正常对照组)的外周血,分离单个核细胞,提取总RNA,用实时定量PCR的方法检测ROG、GATA3和T-bet m RNA水平。应用SPSS16.0软件进行统计分析。结果慢性乙型肝炎轻度、中度组和重度组患者外周血PBMCs中T-bet m RNA表达水平均明显高于健康对照组人群,组内比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。慢性乙型肝炎重度组患者外周血PBMCs中ROG m RNA表达水平明显高于健康对照组人群、轻度组和中度组患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。而轻度组、中度组患者和健康对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。慢性乙型肝炎中度组和重度组患者外周血PBMCs中GATA3 m RNA表达水平明显高于健康对照组人群和轻度组患者,差异均具有统计学意义(P<0.05);而轻度组和健康对照、中度组患者和重度组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。慢性乙型肝炎轻度、中度组和重度组患者T-bet/GATA3比值明显高于健康对照组人群,差异均具有统计学意义(P<0.05);但3组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。ROG表达水平与GATA3和T-bet/GATA3比值均无相关性(P>0.05)。结论 ROG、GATA3和T-bet在慢性乙型肝炎患者外周血PBMCs中表达水平上调,并参与疾病的发生和疾病进展。ROG在纠正和维持Th1/Th2的新平衡状态过程中起重要作用。

康莱特注射液联合肝动脉化疗栓塞术治疗原发性肝癌临床疗效

目的评价康莱特注射液联合肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗原发性肝癌的临床疗效与安全性。方法将64例中晚期原发性肝癌患者随机分为治疗组和对照组。对照组单纯接受TACE治疗,治疗组在TACE治疗的基础上联合使用康莱特注射液。两组患者均在疗程结束后进行KPS评分、有效率、血清甲胎蛋白(AFP)阳性率与不良反应评价。结果治疗后,治疗组KPS评分数值改善程度及上升例数方面均优于对照组(P <0. 05)。治疗组完全缓解1例,部分缓解15例,总有效率50. 0%;对照组完全缓解0例,部分缓解8例,总有效率25. 0%,治疗组总有效率显著优于对照组(P <0. 05)。两组AFP阳性率均有下降,但两组间比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。不良反应为恶心及发热,对照组6例出现恶心,4例出现腹痛,17例合并发热;治疗组2例出现恶心,6例合并发热。但治疗组的不良反应发生率显著低于对照组(P <0. 05)。结论与单纯TACE治疗比较,康莱特注射液联合TACE治疗原发性肝癌可获得更好的临床疗效,且可以有效降低TACE治疗的不良反应。

四君子汤对原发性肝癌术后患者T淋巴细胞和NK细胞的影响及意义

目的:观察四君子汤对原发性肝癌术后患者T淋巴细胞和NK细胞的影响及意义。方法:将符合纳入标准的128例肝癌术后患者随机分为治疗组与对照组。治疗组患者口服四君子汤,对照组患者不另服用药物,观察比较两组患者术后肿瘤复发率及生存率。流式细胞仪测定两组患者第24个月外周血CD4^+、CD8^+和CD16^+CD56^+细胞水平,并进行数据分析。结果:治疗组患者第1、3年肿瘤复发率均低于对照组,差异均有显著性意义(P<0.005);治疗组患者第1、3年生存率均高于对照组,差异均有显著性意义(P<0.001);治疗组患者CD4^+T细胞和NK细胞均高于对照组,差异均有显著性意义(P<0.05);治疗组患者CD8^+T细胞与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:四君子汤提高肝癌术后患者生存率及降低肿瘤复发率的机制可能是调节T淋巴细胞和NK细胞的免疫功能所致。

二维剪切波弹性成像肝硬度值评估慢加急性肝衰竭患者病情变化

【目的】慢加急性肝衰竭(ACLF)患者中,分析肝细胞性黄疸胆红素变化与二维剪切波弹性成像(2D-SWE)肝硬度值(LSM)变化的相关性,评估慢加急性肝衰竭患者病情变化。【方法】2015年1月至2016年3月来中山大学附属第三医院感染科住院确诊的慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACLF-HBV)患者150例。所有病例均行2D-SWE检查,同时记录临床及实验室血生化指标。胆红素变化与肝硬度值变化的相关分析,选用Pearson相关分析及线性回归分析。【结果】121例ACLF-HBV患者获得有效LSM纳入研究分析。以总胆红素(TB)水平变化为病情分组依据,胆红素下降组和胆红素未下降组。胆红素下降组的2D-SWE肝硬度值下降了5.1(2.2~6.6)kPa,与肝硬度值的变化具有相关性的指标有谷丙转氨酶(ALT),总胆红素(TB),谷氨酰转肽酶(GGT)。胆红素未下降组其2D-SWE肝硬度值上升了6.2(1.2~12.8)kPa,与肝硬度值的变化具有相关性的指标有ALT,TB。胆红素下降组,随胆红素下降,肝硬度值下降,患者达临床好转标准,平均住院时间为(30±15)d,反映病情好转;胆红素未下降组,随胆红素上升,肝硬度值呈增加趋势,至随访终点,4例死亡,6例行肝移植治疗,其余患者未达临床好转标准。胆红素未下降组,6例患者行肝移植治疗。随访终点移植前,患者胆红素高于20倍正常上限值,2D-SWE肝硬度值均有不同程度升高。病理结果显示肝细胞呈亚大块坏死伴结节状增生,毛细胆管内淤胆。【结论】慢加急性肝衰竭患者发生肝细胞坏死程度加重致胆红素持续升高,肝硬度值明显升高,反映患者病情加重;反之,肝硬度值持续下降,反映病情好转。

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与人乙型肝炎病毒(HBV)X基因的重组表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)与GFP融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBV X基因片段,PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点,转化宿主菌DH5#,采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx;采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBV X基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBV X重组表达载体pGFP-HBx;将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2,经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次,细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2/GFP-HBx细胞有HBV X转录、表达。结论成功构建了GFP-HBV X真核重组表达载体pGFP-HBx;获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系,这为进一步研究HBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。

肝癌转移相关分子的血清蛋白质组学分析

目的应用差异蛋白质组学方法筛查血清中与肝癌转移相关的蛋白质分子。方法收集具有相同疾病背景原发性肝癌(肝内转移和未转移)患者以及正常人的血清(每组各20例),经过去高丰度蛋白预处理后,进行双向电泳(2-DE)分析,筛选出肝内转移肝癌与未转移肝癌相比较有显著性差异的蛋白质斑点,进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定;使用Western blotting验证蛋白质组分析的结果。结果对3组血清的双向电泳图谱分析,与正常人和未转移肝癌患者的血清相比,在肝内转移肝癌血清中共筛选出12个差异大于2倍的蛋白质斑点,MALDI-TOF/TOF成功鉴定出3个表达下调的蛋白质[包括Inter-alpha(globulin)inhibitor H4、Complement factor H-related protein1precursor(FHR-1)、apolipoprotein E]和一个上调蛋白(Cytokeratin9,CK9)。Western blotting对所有样本血清中的CK9进行了检测,结果与蛋白质组分析结果相一致。结论肝癌的转移与多种蛋白表达改变相关,其中CK9的高表达可能与肝癌的转移有关,可能作为肝癌转移相关的潜在血清标志物。

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】探讨一种高效稳定分离和扩增人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的方法。【方法】取脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法(12例)和酶序贯消化法(8例)来分离、提取hUC-MSC,比较两种方法分离hUC-MSC的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM(LG-DMEM)完全培养基和LD-Mesen培养基(MesenProRSTM与LG-DMEM的混合培养基)分别培养hUC-MSC,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%(12/12)和12.5%(1/8),两者相比有显著统计学差异(P=1.03×10-4),前者原代培养平均时间为(14.17±1.14)d,获得细胞(1.30±0.14)×106个。2×105个hUC-MSC用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12 d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,两者有显著统计学差异(P=1.38×10-8)。hUC-MSC高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】酶联合消化Wharton's Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSC,效率明显优于传统方法。

过继免疫细胞治疗预防肝癌肝移植术后复发的新思路探究

我国是肝病大国，也是全球原发性肝癌（肝癌）的第一大国。我省更是肝炎、终末期肝病、肝癌的重灾区，广东地区肝脏疾病发病率高达近20％，严重危害着民众的健康。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第2位，每年大约有11万人死于HCC，占全世界HCC死亡人数的45％。

肝癌相关成纤维细胞对肝细胞肝癌影响的实验研究

目的探讨肝癌相关成纤维细胞(hCAF)对肝细胞肝癌(肝癌)转移的影响。方法分别将hCAF和正常成纤维细胞(NF)培养2~3 d,行免疫荧光染色,观察hCAF和NF细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞表面蛋白(FSP)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、波形蛋白(vimentin)的表达情况。通过hCAF与MHCC97L-绿色荧光蛋白(GFP)、HepG2-GFP肝癌细胞共培养及划痕实验,观察hCAF对肝癌细胞的形态变化的影响及其对肝癌侵袭转移能力的作用。结果 hCAF和NF细胞均表达α-SMA、FSP、FAP、vimentin,但hCAF表达α-SMA与FAP的水平明显高于NF。hCAF与肝癌细胞共培养至96 h,MHCC97L-GFP细胞生长由典型的抱团样成簇生长,变成分散呈播散样生长;HepG2-GFP细胞由多角形的上皮细胞形态转变为长梭形的间质细胞形态。MHCC97L-GFP、HepG2-GFP肝癌细胞与hCAF共培养5 d后划痕明显较NF组缩小。结论 hCAF能加速肝癌细胞发生类似上皮细胞间质转型的变化,增强肝癌细胞侵袭转移能力。

HGF与CTLA-4Ig双基因修饰增强脐带间充质干细胞的免疫抑制和促增殖作用

【目的】探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)经肝细胞生长因子(HGF)和细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)双基因修饰后免疫调节能力的变化及其促进肝细胞增殖作用的影响。【方法】酶联合消化法提取并鉴定人脐带间充质干细胞;对照组的hUCMSC转染携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad5-EGFP,实验组的hUCMSC转染携带HGF和CTLA-Ig双基因的腺病毒Ad5-HGF/CTLA-4Ig。流式细胞仪检测对照组hUCMSC转染Ad5-EGFP后72 h表达EGFP细胞比率;实验组Ad5-HGF/CTLA-4Ig转染hUCMSC 72 h后,CCK8检测细胞存活率,同时再次检测hUCMSC免疫表型和向成骨细胞分化的能力,ELISA检测细胞上清中HGF含量,Western blot检测细胞中CTLA4-Ig蛋白的表达水平,通过CCK8法检测双基因修饰后hUCMSC对淋巴细胞增殖的影响及其上清对L02细胞增殖的影响。【结果】携带外源基因的腺病毒可有效转染hUCMSC,不影响其干细胞特性和多向分化能力,经HGF/CTLA-4Ig基因修饰hUCMSC可分泌高浓度HGF并高表达CTLA-4Ig,同时能有效地抑制淋巴细胞增殖,其上清能明显促进肝细胞增殖。【结论】hUCMSC经HGF/CTLA-4Ig基因修饰后生物学特性无明显改变,并能高表达HGF和CTLA-4Ig,其免疫调节及促进肝细胞增殖的能力进一步加强,为肝移植术后存在的肝细胞损伤的保护治疗提供了新思路。

华支睾吸虫钙调节蛋白的生物学特性及与肝纤维化的关系

目的：对华支睾吸虫成虫（Clonorchis sinensis, Cs）钙调节蛋白（CaM）进行生物学及功能分析，以确定其在肝纤维化中的作用。方法从Cs cDNA质粒文库中寻找CsCaM全长序列，以BLASTx搜索其同源序列并进行比对分析。以生物信息学进行同源比对、理化性质分析及功能域预测。以分子生物学方法进行原核克隆，大肠杆菌表达，亲和层析纯化，并将纯化蛋白免疫大鼠，产生多克隆抗体。ELISA检测CsCaM抗体滴度及产生曲线。免疫印迹实验分析CsCaM重组蛋白纯化及其抗体识别效果。免疫组化分析其组织定位；腹腔注射法建立CsCaM致大鼠肝纤维化模型。结果重组、表达及纯化了CsCaM，其编码150位氨基酸，理论相对分子质量23400。结构域预测其具有EF手位模序。pET-30a-CsCaM重组质粒其目的蛋白表达于宿主菌BL21 E. coli上清，相对分子质量约23400。总IgG抗体滴度于2~4周达较高峰，效价大于1∶51200。免疫组织化学定位显示CsCaM在成虫睾丸表达丰富。CsCaM腹腔注射大鼠的肝脏均显示不同程度病变，HE染色可见炎症反应较严重，可见气球样变、门管区炎及碎片状坏死；网状纤维染色显示小胆管周围胶原增生，有轻到中度纤维化。结论 CsCaM促进大鼠肝脏炎症病变及纤维化的作用，提示其可能参与了华支睾吸虫病致肝纤维化的作用。

乙腈预处理血清寻找肝细胞癌发病相关的蛋白质

【目的】应用乙腈(ACN)预处理血清的方法,对肝细胞癌(HCC)患者的血清进行蛋白质组分析,寻找与HCC发病相关的蛋白质。【方法】收集原发性HCC患者和健康人的血清各12例,首先使用乙腈预处理,然后去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白质,再进行双向电泳(2-DE)分析,筛选HCC与健康对照血清中有显著性差异的蛋白质斑点,并进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定。【结果】血清经0%、20%和30%浓度的乙腈预处理后,进行2-DE分析发现蛋白质斑点的检出数量分别为532±96、623±102和674±123;对预处理后HCC患者和正常人的血清进行差异分析,发现甲状腺素(Tetraiodo-L-Thyronine)和Proapolipoprotein的表达上调,而维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding Protein)和铁传递蛋白(Transferrin)的表达下调。【结论】对血清样本的蛋白质组分析,应用乙腈预处理会增加与白蛋白非特异性结合的蛋白质的检出;HCC患者血清中甲状腺素等4个蛋白的表达异常与HCC相关。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体减轻肝脏缺血再灌注损伤及机制的初步研究

目的探讨人脐带间充质干细胞来源的外泌体(huc MSCs-exo)对肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是否具有保护作用及可能的作用机制。方法利用贴壁法提取原代人脐带间充质干细胞(huc MSCs),超速离心方法提取细胞培养上清中的外泌体,分别进行鉴定;在体外实验中利用L02细胞缺氧复氧损伤模型探究huc MSCs-exo对细胞凋亡蛋白表达水平的影响;在体内实验中建立C57BL/6小鼠70﹪HIRI模型,72只小鼠随机分成四组,分别为Sham组(n=18)、IRI组(n=18)、PBS组(n=18)和exo组(n=18)。术后第6 h(n=6)、12 h(n=6)及24 h(n=6)通过检测血清AST及ALT水平、进行肝脏HE染色及CASPASE-3免疫组化实验,进一步探究huc MSCs-exo对HIRI的作用,多组组间比较采用方差分析。结果首先成功分离提取原代huc MSCs及huc MSCs-exo并进行鉴定;在体外,通过Western Blot实验证明huc MSCs-exo可降低L02细胞缺氧复氧(1﹪O2缺氧6 h,复氧2 h)损伤后细胞凋亡蛋白cleaved-CASPASE-3及cleaved-PARP表达水平;在体内,huc MSCs-exo处理后血清转氨酶水平较IRI组有所降低,这种差异在再灌注12 h的AST[(2895.0±998.6)U/L vs(971.8±797.8)U/L,t=4.010,P=0.004]及再灌注24 h的AST[(1926.0±377.2)U/L vs(597.2±524.8)U/L,t=5.231,P=0.000]、ALT[(2074.0±750.3)U/L vs(555.3±493.8)U/L,t=4.379,P=0.002]中具有统计学意义,肝脏HE染色及肝组织CASPASE-3免疫组化结果同样提示huc MSCs-exo可减轻C57BL/6小鼠70﹪HIRI。结论 Huc MSCs-exo可通过抗凋亡机制减轻HIRI,这为临床缓解HIRI提供新的治疗方向,其具机制有待进行更深入的研究。