不同类型的人诱导多能干细胞异种嵌合能力的比较研究

目的比较不同培养方法建立不同类型的人诱导多能干细胞(hiPSC)的嵌合情况,筛选高异种嵌合能力的hiPSC。方法2022年9月至2023年10月,中山大学附属第一医院显微创伤手外科根据文献报道的方法,使用100只雌性C57小鼠、20只雄性C57小鼠和10只多重免疫缺陷鼠(NOD/SCID),通过不同的化学小分子诱导培养方法建立8细胞期胚胎样细胞(8CLC)、潜能扩展多能干细胞(EPS)、原始态多能干细胞(Naïve iPSC)、形成态多能干细胞(Formative iPSC)和始发态多能干细胞(Primed iPSC)。利用形态学观察、细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR和畸胎瘤形成进行细胞系鉴定。将各种不同的细胞系使用CRISRR/CAS 9基因编辑技术标记GFP,筛选并扩增阳性细胞后,进行小鼠囊胚期注射,每次注射10个细胞形成嵌合胚胎,并将嵌合胚胎进行体外胚胎培养,观察评估嵌合情况。所有计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示,各亚组间的比较均先采用ANOVA单因素方差分析,再通过Bonferroni法进行两两比较,P<0.05表示差异有统计学意义。结果依据形态学、细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR、畸胎瘤形成实验的鉴定与验证,成功培养出了8CLC、EPS、Naïve、Formative、Primed这5种代表胚胎发育不同阶段的iPSC细胞系。小鼠囊胚期注射后进行体外培养,发现8CLC和Naïve iPSC相比其他细胞系,第3天(两细胞系分别为74.28%和56.00%)和第5天(分别为62.85%和40.00%)的GFP阳性率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论8CLC和Naïve iPSC作为供体细胞更有利于人-鼠异种嵌合胚胎的体外培养,有益于提高人-鼠异种嵌合后胚胎的嵌合率。

关键点矩阵技术用于手指关节运动角度无接触式智能测量的可行性研究

目的探讨关键点矩阵技术用于手指关节运动角度无接触式智能测量中的可行性。方法将2021年5月—11月符合选择标准的33名志愿者纳入研究。其中男20名,女13名;年龄16~70岁,平均30.2岁。利用关键点矩阵技术和手工角度尺分别测量志愿者五指14个关节伸直(含过伸)角度和四指(不含拇指)12个关节屈曲角度。随机选择5名志愿者行小样本组间重复测量对比观察,评价测量方法的重复性及准确性;随机选择28名志愿者行大样本配对准确性比较观察,评价测量方法的准确性。结果关键点矩阵技术测量手指关节运动角度的平均重复性分别为1.801°(伸直)和7.823°(屈曲)。与手工测量相比,手指各关节伸直角度平均差值为3.225°,屈曲角度平均差值为14.145°。两种方法测量结果整体一致性较强(ICC=0.875),单个关节的测量结果一致性大部分处于中等强度水平(ICC中位数为0.440)。两种方法测量结果在关节伸直时主要表现为正相关(P<0.05),在关节屈曲时主要表现为负相关(P<0.05)。结论基于关键点矩阵技术的手指关节运动角度测量重复性和准确性好,各关节伸直角度和各掌指关节屈曲角度的准确性符合临床要求。

载硫酸软骨素蛋白多糖神经套管阻止大鼠坐骨神经缝接口处再生轴突逃逸

目的观察载硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)神经套管在SD大鼠坐骨神经横断伤端-端缝合口处的作用,并进一步观察其对周围神经损伤后修复的效果。方法利用明胶作为载体构建载CSPGs神经套管,用于保护SD大鼠坐骨神经横断伤端端缝合口。2019年7月至9月,24只SD大鼠随机分为直接缝合组、空白组(无CSPGs的明胶套管)和套管组(载CSPGs套管),每组8只。术后5周时,每组3只大鼠行荧光金注射以标志术侧背根神经节的感觉神经元,其余5只大鼠于术后6周行电生理学检测后分别取材,用于神经组织的苏木精-伊红(HE)染色及镀银染色,同时取术侧腓肠肌行Masson染色,评估缝合口处坐骨神经的再生情况及神经损伤后再生修复效果。采用单因素方差分析进行数据分析,如果组间差异有统计学意义,则进一步采用LSD法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果组织学结果表明,在坐骨神经端-端缝合口处,再生神经纤维均有不同程度的紊乱再生及逃逸现象,直接缝合组、空白组和套管组再生神经纤维的逃逸距离分别是(787.19±213.77)μm、(547.17±167.71)μm和(350.60±68.58)μm,通过缝合口进入远端基底膜管的再生轴突数目分别是(6360±736.89)个/mm^2、(8040±673.05)个/mm^2和(9000±644.20)个/mm^2,术侧背根神经节中被荧光金标记的感觉神经元数目分别是(124.35±25.88)个/mm^2、(165.36±30.74)个/mm^2和(208.98±20.51)个/mm^2,套管组与另外两组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);电生理检测及术侧腓肠肌的组织学切片均显示套管组神经损伤后再生修复效果比另外两组更好(P<0.05)。结论载CSPGs神经套管可通过CSPGs对再生轴突的抑制作用,有效减少再生神经纤维在坐骨神经横断伤端-端缝合口处的逃逸及紊乱再生,从而促进大鼠坐骨神经损伤后有效再生。

硫酸软骨素蛋白多糖对周围神经有序再生作用的研究进展

周围神经损伤后再生常会出现错配、卷曲及迷乱等新生轴突无序再生的情况,这是限制周围神经损伤后有效再生的重要原因之一,因此实现周围神经损伤后的有序再生,有助于提高再生的效率与功能恢复。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)作为传统的轴突再生抑制性分子,在周围神经系统正常发育过程中具有重要作用。本文从CSPGs的分类、作用特点及其时空分布等方面来探讨其在促周围神经有序再生过程中所扮演的角色及应用转化的可能性,有助于增加轴突再生数量的神经移植物的设计,进一步指导周围神经移植物的仿生构建,从而促进周围神经损伤后的有序及有效再生。

Etifoxine通过上调CELSR2蛋白表达促进RSC96增殖及迁移

目的探讨艾替伏辛(Etifoxine)对大鼠许旺细胞(RSC96)增殖和迁移的影响及分子机制。方法2020年3月-2020年10月,观察Etifoxine对RSC96 SCs增殖和迁移的影响,将细胞分为20μmol/L Etifoxine组和生理盐水组,处理48 h后使用EDU细胞增殖检测试剂盒、Transwell实验以及划痕实验检测细胞增殖和迁移能力的变化。观察Etifoxine对RSC96、表皮生长因子样蛋白2抗原(CELSR2)蛋白表达的影响,建立Etifoxine浓度梯度,将细胞分别用生理盐水组和5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L Etifoxine进行培养,48 h后通过Western blot检测各组细胞CELSR2蛋白表达。探讨CELSR2是否为Etifoxine的潜在作用靶点,将细胞分为20μmol/L Etifoxine加CELSR2 siRNA组和20μmol/L Etifoxine加Control siRNA组,处理48 h后再次检测细胞增殖和迁移情况。采用非参数Mann-Whitney检验进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果EdU和Transwell实验结果显示,20μmol/L Etifoxine处理组RSC96细胞增殖率(36.30±3.09)%、迁移细胞数量(132.30±6.77)均高于对照组[分别为(19.40±2.50)%和65.33±7.37],24 h和36 h划痕愈合率分别为(30.67±2.16)%和(86.00±2.19)%,均高于对照组[分别为(23.00±2.61)%和(49.67±2.81)%],差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,随着Etifoxine浓度升高,RSC96细胞CELSR2蛋白表达增多(P<0.05),但10μmol/L和20μmol/L Etifoxine组蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。经20μmol/L Etifoxine处理的RSC96细胞转染CELSR2 siRNA后,与对照组相比,细胞增殖率、迁移细胞数量以及24 h/36 h划痕愈合率均明显下降(P<0.05)。结论Etifoxine可促进RSC96增殖及迁移,而且Etifoxine诱导的增殖和迁移促进作用与RSC96 CELSR2蛋白表达上调相关。

外源性miR206抑制Myostatin表达影响大鼠失神经性肌萎缩的进程

目的探讨miR206在骨骼肌失神经萎缩中的作用机制。方法 2020年9月至2020年12月,共选取40只SPF级SD大鼠进行本研究。应用16只SD大鼠剪除后肢坐骨神经1 cm建立腓肠肌失神经支配模型,分别在腓肠肌失神经支配时间0、3、7、14 d分为4组取材,每组4只,将样本进行湿重比测定观察无干预下大鼠肌肉失神经萎缩的变化。另24只大鼠同样建立腓肠肌失神经支配模型,并分为3组,每组8只,分别为:去神经加miR206转染组、去神经加对照转染组和假手术组,于失神经支配7 d后取材。将样本进行湿重比测定和Masson染色下肌纤维横截面积测量来评估肌肉萎缩的程度,并通过Western blot和qPCR检测腓肠肌中Myostatin和miR206的表达水平来评估二者的关系。细胞实验中,以C2C12细胞为对象,将带Myostatin(MSTN)mRNA 3’UTR端的荧光质粒和带mut MSTN mRNA 3’UTR端的荧光质粒,分别与mmu-miR206、mmu-miR206抑制剂、NC和NC抑制剂共转染,通过荧光素酶报告分析,对比各组的荧光强度来验证miR206和Myostatin的靶向关系。两组数据间比较采用t检验,多组数据结果间比较采用单因素方差分析,若组间差异有统计学意义,进一步以Bonferroni法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果在去神经组观察中发现,大鼠腓肠肌湿重比整体随失神经支配时间延长而降低,于第7天时最为明显。去神经加miR206转染组、去神经加对照转染组和假手术组的腓肠肌湿重比分别为0.63±0.04、0.51±0.02和1.05±0.02,肌纤维横截面积分别为(761.30±21.79)、(640.30±30.31)和(1 066.00±51.65)μm^(2),各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,去神经加miR206转染组中Myostatin的蛋白相对表达量低于去神经加对照转染组,qPCR结果显示两组Myostatin的mRNA相对表达量分别为0.57±0.04和0.81±0.04。无论蛋白和mRNA,去神经加miR206转染组中的相对表达量均低于去神经加对照转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。荧光素酶报告分析显示, mmu-miR206共转染MSTN荧光质粒组的荧光相对强度是(0.26±0.07),显著低于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性miR206能通过特定的作用靶点来抑制Myostatin的表达,进而在大鼠腓肠肌失神经性肌萎缩中发挥积极的作用,并且二者间存在靶向作用的可能。