萎蔫酸铜离子络合物、镉离子络合物的抗结核活性及对结核分枝杆菌基因表达的影响

目的研究海洋微生物代谢产物萎蔫酸金属铜离子络合物与镉离子络合物体外抗结核活性,以及对Mtb H37Rv基因表达的影响。方法应用纸片扩散法(Kind-Bauer,K-B法)初步鉴定萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物的抗结核活性,重复实验3次;绝对浓度间接法测定萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),重复实验确定更准确的MIC;Mtb cDNA芯片检测萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物处理Mtb组与溶剂对照处理Mtb组表达差异的基因,重复实验一次。结果萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物在卡介苗(BCG)平板抑菌圈直径分别为(30.4±0.6)mm、(30.0±0.8)mm。萎蔫酸铜离子络合物抗Mtb H37Rv的MIC为10μg/ml;对耐多药结核分枝杆菌,萎蔫酸镉离子络合物MIC为7.5μg/ml,低于S(MIC=25μg/ml)和RFP(MIC=25μg/ml);对Mtb临床分离株(0907961,耐S和EMB),萎蔫酸铜离子络合物的MIC(10μg/ml)低于S(S的MIC为20μg/ml),萎蔫酸镉离子络合物的MIC(5μg/ml)均低于S(MIC=20μg/ml)、EMB(MIC=6.4μg/ml)。Mtb cDNA芯片检测发现萎蔫酸铜离子络合物处理组与溶剂对照组比较,有差异表达的基因总数为23条,其中已知功能基因有10条;萎蔫酸镉离子络合物处理组与溶剂对照组比较,有差异表达的基因总数为28条,其中已知功能基因有11条。这些存在差异的基因功能涉及核苷酸、脂质、能量、辅酶、氨基酸代谢,DNA的复制、转录、翻译、翻译后修饰以及细胞膜的生物合成等。结论萎蔫酸铜离子络合物与萎蔫酸镉离子络合物具有较好的体外抗结核活性,尤其对部分耐药菌株的抑制作用甚至优于抗结核一线用药,可作为抗结核药物的前导化合物;运用基因芯片所探究出的差异表达的基因为进一步深入研究其抗菌作用机制提供了一定的实验依据。

酶联免疫斑点法对抗结核治疗期肺结核患者多肽特异性IFN-γ的检测

目的运用酶联免疫斑点法检测结核患者外周血IFN-γ,探讨结核患者结核多肽特异性IFN-γ分泌水平随抗结核治疗的变化。方法采用结核混合多肽E6+E7+C14、E6+E7作为刺激抗原,对331个处于治疗前或1、2、3、4、5和6个月治疗期的肺结核患者外周血标本进行多肽特异性IFN-γ酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测。结果治疗前的肺结核患者其ELISPOT阳性检测率均高于痰涂片和痰培养阳性率(E6+E7+C14-ELISPOT92.5%、E6+E7-ELISPOT89.7%、痰涂片41.0%、痰培养59.0%),且差别均有统计学意义(P<0.010和P<0.001)。在抗结核治疗各个时期,肺结核患者IFN-γ-ELISPOT检测阳性率和斑点数(spotformingcells/106cells,SFP)随着治疗的进行持续下降,由治疗前高水平(E6+E7+C14-ELISPOT阳性率92.5%、SFP计数中值M=381;E6+E7-ELISPOT阳性率89.7%、SFP计数中值M=168)降至第6个月治疗结束时低水平(E6+E7+C14-ELISPOT43.6%、M=40;E6+E7-ELISPOT38.1%、M=36)。痰涂阳性患者的SFP计数持续处在高位,且治疗6个月痰涂阳性患者的SFP计数显著高于痰涂阴性患者。结论两种混合多肽IFN-γ-ELISPOT可提高结核患者的诊断率,同时检测抗结核治疗患者的IFN-γ分泌水平以监测抗结核治疗的效果。

结核特异性多肽E6、E7和C14对单核-巨噬细胞亚型极化的影响

目的运用流式细胞术检测单核-巨噬细胞极化亚型M1(CD14^+CD16^+)及M2(CD14^+CD163^+),探讨结核特异性多肽对单核-巨噬细胞极化分型的影响。方法以3种结核特异性多肽E6、E7和C14作为刺激物,刺激人急性白血病单核细胞株(THP-1细胞)、结核病患者胸水单个核细胞及外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞术检测刺激物不同时间点对单核-巨噬细胞极化表面标记表达的影响。结果结核特异性多肽E6刺激THP-1 24+0 h、24+24 h、24+48 h、24+72 h后,CD16/CD163阳性率分别为16.85%/13.78%、19.59%/15.68%、18.14%/14.19%、13.61%/11.47%。E7刺激效果与E6相似,C14对THP-1的CD16/CD163表达影响不如前两种多肽强。结核特异性多肽E6刺激结核患者胸水或血标本单核细胞19 h后,CD14+CD16+阳性率(1#患者:1.66%,2#患者:4.37%)与CD14^+CD163^+阳性率(1#患者:1.76%,2#患者:2.82%)差异不大,但CD14^+CD16^+CD86^+阳性率(1#患者:2.20%,2#患者:6.16%)大于CD14^+CD163^+CD206^+阳性率(1#患者:1.37%,2#患者:0.92%)。E7刺激效果与E6相似,C14对结核患者胸水或血标本单核细胞CD14/CD16/CD163表达影响不如前两种多肽强。结论 3种结核特异性多肽特别是E6、E7体外刺激单核细胞株THP-1、结核患者胸水或血标本单核细胞主要向M1型单核-巨噬细胞极化。

结核特异性CD4^+ α/β TCR四聚体细胞株筛选技术的建立和应用

目的应用不同的MTB多肽以及不同的HLA-DR基因构建的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR复合物的S2恒定细胞株,即人工APC筛选、鉴定结核特异性CD4+α/βTCR四聚体。方法以PE标记的CD4+α/βTCR四聚体、FITC标记的抗HLA-DR抗体(L243),分别与未诱导表达或CuSO4诱导表达后的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR的果蝇S2恒定细胞株,以及与无多肽或结合有结核多肽的、表达HLA-DR的S2细胞株共孵育,流式细胞技术检测分析TCR四聚体与各种细胞株结合率的差异。结果 TCR四聚体6M、6N均与2#细胞株,即C5/HLA-DRB1*0404(1.73%、5.93%)等具有较高的阳性结合率;结核抗原肽孵育后,一些人工APC的四聚体阳性结合率有所提高;所筛选的9个TCR四聚体均与2#细胞株有较高的结合率。结论膜表达结核抗原肽/HLA-DR的S2细胞株,可以应用于结核特异性CD4+α/βTCR四聚体的筛选、鉴定;构建的9个CD4+α/βTCR四聚体均为结核特异性。

SARS-CoV-2棘突蛋白特异性多肽的筛选及初步验证

目的筛选及初步验证新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白(S蛋白)的特异性多肽。方法用多种生物信息学软件对SARS-CoV-2 S蛋白区别于HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV S蛋白氨基酸序列的特异性序列进行筛选并预测其理化性质、空间结构。根据筛选、预测结果,将SARS-CoV-2 S蛋白特异性序列进行化学合成或人工表达。运用酶联免疫吸附(ELISA)实验验证这些基于生物信息学筛选出的特异性多肽的抗原性、免疫原性以及证明抗原性最强的特异性多肽在实际应用中检测COVID-19抗体阳性患者血清的可行性和特异性。结果选出5条具有抗原性与免疫原性的多肽,S2、S3、S6、S7,以及S6与S7用linker连接大肠埃希菌表达的小分子融合蛋白(S6-Linker-S7);S6-Linker-S7与SARS-CoV-2 S蛋白对比检测同一批普通呼吸系统疾病患者血清IgG抗体平均检测值OD_(450)nm分别为(0.70±0.34)、(1.33±0.54),检测值差异具有统计学意义(P<0.001),对比检测COVID-19抗体阳性患者血清IgG抗体检测值OD_(450)nm分别为(2.20±1.95)、(2.35±0.57),检测值差异不具有统计学意义(P>0.05);S6-Linker-S7在检测COVID-19抗体阳性患者时,血清IgG抗体检测值OD_(450)nm均值比检测普通呼吸疾病患者OD_(450)nm均值高3倍,差异具有统计学意义(P<0.001);SARS-CoV-2 S蛋白与HCoV-HKU1、HCoV-OC43、SARS-CoV S蛋白兔多抗发生免疫反应;S6-Linker-S7与抗HCoV-OC43、SARS-CoV S蛋白兔多抗发生免疫反应。结论实验证明了针对SARS-CoV-2 S蛋白,基于生物信息学技术设计合成的区别于HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV的特异性多肽具有抗原性和免疫原性,S6-Linker-S7能在实际应用中检测COVID-19抗体阳性患者血清,并且相较于SARS-CoV-2 S蛋白具有更高的特异性。

2012-2013年广州地区呼吸道合胞病毒感染的流行特征分析

目的分析2012-2013年广州地区急性呼吸道感染人群中呼吸道合胞病毒（RSV）感染的流行状况和流行特点,为RSV感染的治疗和预防提供参考。方法收集2012年1月至2013年12月广州地区11家哨点医院发热同时伴有呼吸道感染症状病人的鼻咽拭子标本3 943份,采用巢式PCR的方法检测RSV的核酸,同时结合患者的临床基本信息,分析RSV的感染情况和人群、时间分布特点,对RSV阳性的标本进一步进行流感病毒（IFV）等7种常见呼吸道病毒的检测以了解其多重感染情况。结果共收集3 943份鼻咽拭子,1 374份来自门急诊病例,2 569份来自住院病例,男性2 446份,女性1 497份,年龄范围从0~98岁。共检出RSV阳性标本419份,检出率为10.63%,其中住院病例检出率（15.30%）高于门急诊病例（1.89%）,男性检出率（11.28%）高于女性检出率（9.55%）,差异均有统计学意义（P〈0.05）。所有人群中,婴幼儿（0~3岁）的检出率最高,为20.18%,占所有阳性病例的81.86%,随着年龄的增长RSV感染有下降趋势,中老年人的检出率有所升高。RSV感染的高峰期在1-4月,不同月份RSV的检出率差异有统计学意义（χ^2=3 068.914,P〈0.05）。阳性病例中100例病例混合感染了至少一种其他呼吸道病毒,占RSV总阳性病例的23.87%,85例为双重感染（85%）,15例为三重感染（15%）,流感病毒是最常见的混合感染病毒。结论 2012-2013年广州地区RSV感染以婴幼儿为主;住院病例感染率高于门急诊病例;高峰为1-4月,最常见的混合感染病毒是IFV。

2011-2013年广州地区腹泻病毒的病原学研究

目的调查2011-2013年广州地区7种主要腹泻病毒的流行状况和特点。方法收集2011-2013年广州地区腹泻患者粪便标本1 587份,采用ELISA检测粪便标本中A组轮状病毒抗原,用荧光定量RT-PCR的方法对采集的粪便标本进行6种病毒核酸检测,结合病人的临床资料进行病原学特征分析。结果 1 587份粪便标本中571例检出为腹泻病毒阳性,检出率为35.98%,主要腹泻病毒的检出率分别为：A组轮状病毒18.15%（288/1 587）、诺如病毒12.10%（192/1 587）、腺病毒6.87%（109/1 587）、星状病毒1.83%（29/1 587）、札如病毒0.69%（11/1 587）、B组轮状病毒0.25%和C组0.19%;腹泻病毒在1~岁婴幼儿和75~93岁老人腹泻病毒的总检出率最高,分别为57.57%和51.65%,在7~15岁少年检出率降到最低24.36%;〈3岁婴幼儿、3~74岁人群、75~93岁老人组检出率分别为43.62%、30.66%、51.56%,差异有统计学意义（P〈0.05）;男女检出率差异无统计学意义（P〉0.05）;腹泻病毒全年均可检出,夏季以诺如病毒感染为主而秋冬季以A组轮状病毒感染为主。结论 2011-2013年间广州地区腹泻病毒发病率较高,全年均有检出;发病率无性别差异;流行高峰出现在3月份;3岁以下幼儿和75岁以上老人是腹泻病毒监测的重点人群。

广州市及周边地区2011年手足口病病原学与分子流行病学调查

目的对广州市及周边地区手足口病(HFMD)的流行病学和病原学特征进行分析。方法收集2011年广州市及其周边地区手足口病病例968份,采用荧光定量RT-PCR方法对采集的标本进行肠道病毒(EV)核酸检测,将其分为肠道病71型(EV71)、萨克奇病毒A组16型(CA16)、非EV71、CA16阳性肠道病毒(N)三类,分离部分EV71毒株并进行全基因测序和分析。并用生物信息学软件进行病毒基因特征分析,经在线比对后进行EV型别鉴定。结果分析显示2011年广州市及周边地区HFMD的高发年龄段为年龄小于4岁的儿童,1～2岁婴幼儿发病率最高;5-7月为发病高峰期;EV71和CA16为HFMD的主要病原;但有24.79%的病例由其他肠道病毒(EV)型别引起。基于全基因序列构建种系发生进化树显示,所分离的6株EV71毒株与C4亚型毒株具有最近的亲缘性和最高的同源性。结论2011年EV71和CA16为广州市及周边地区流行的主要病原,EV71病毒株分离株属于C4型,且遗传性较稳定,但存在部分其他型别EV引起HFMD。

2012-2013年广州地区鼻病毒感染的流行病学调查

目的了解2012－2013年广州地区呼吸道感染人群中人鼻病毒（HRV）感染的流行特征。方法收集2012－2013年广州市5家哨点医院符合条件的有发热并伴有呼吸道感染症状患者的咽拭子标本2124份，采用实时荧光定量PCR检测标本中HRV的核酸，同时结合患者的临床基本信息，分析HRV的感染情况、人群分布和时间分布等。对HRV阳性的标本进一步进行流感病毒（IFV）、呼吸道合胞病毒（RSV）等7种常见呼吸道病毒的检测，以了解其共感染情况。结果共收集咽拭子2124份，1254份来自门诊急诊病例，870份来自住院病例；男性1253份，女性871份，男女检出率无明显差异；年龄范围0个月到103岁。HRV检测阳性的标本有101份，阳性检出率为4．76％；阳性标本中20例混合感染了至少一种其他呼吸道病毒，占HRV阳性标本的19．80％；IFV是最常见的混合感染病毒。HRV全年散发，秋季检出率最高（6．13％），冬季最低（1．51％），不同季节检出率差异有统计学意义（x2=10．592，P〈0．05）。尤以感染0～4岁的婴幼儿和65岁的老年人为主，中青年检出率低。结论广州地区HRV以感染儿童和老年人为主，尤其是4岁以下的婴幼儿；全年均可发生；男女感染率无明显差异；与IFV混合感染率较高。

2011-2013年广州地区发热呼吸道感染患者的人流感病毒监测及其亚型的流行特征分析

目的了解2011-2013年广州地区发热呼吸道症候群患者的人流感病毒及其亚型流行特征。方法收集广州市2011-2013年5家哨点医院共2 085例发热同时伴随有呼吸道感染症状病人的咽拭子标本及相关临床信息,对人流感病毒进行筛查,并结合临床信息,分析其流行特征。结果 2011-2013年收集到的2 085份样本中237例经普通PCR检测为人流感病毒阳性,检出率为11.4%,其中人流感病毒甲型和乙型阳性的标本分别为202例和35例（阳性率分别为9.68%和1.68%）,以甲型流感为主;人流感病毒阳性率最高组别为学生（大中小学生）组,就诊率最高科室为儿科;男女比例1.34：1,性别发病率差异无统计学意义;亚型流行高峰呈不均匀分布,其中流感病毒甲型发病高峰为3-5月;流感病毒乙型分布较为分散;广州地区人流感病毒是以0~岁组、7~岁组及18~39岁年龄组易感,各年龄组发病率差异有统计学意义;广州地区甲型流感病毒也是以18~39岁组高发,各年龄组发病率差异无统计学意义;乙型感染则以7~17岁组发病率最高。结论 2011-2013年广州并未暴发大型的人流感病毒疫情,人流感病毒以甲型流感为主,乙型流感也有散发,未发现丙型流感病毒感染;流行高峰出现在3-5月,18~39岁年龄组发病率最高。

2012-2015年广州地区人冠状病毒及其亚型流行病学特征

目的对2012-2015年广州地区发热呼吸道感染患者中人冠状病毒（HCoV）及亚型进行监测,分析其流行特征,为HCoV的预防和监控提供参考依据。方法收集2012年7月至2015年7月期间广州地区14家哨点医院符合标准的发热呼吸道感染病人的咽拭子标本,采用Real-time PCR方法进行HCoV及亚型检测,对HCoV阳性标本同时检测其它7种呼吸道病毒以了解混合感染情况;检测结果采用SPSS17.0统计分析,Excel作图表,结合病例信息,从人口学特征、年龄、季节、性别等方面对HCoV及亚型的流行特征进行分析。结果 2012-2015年间共收集了5 519份咽拭子标本,其中HCoV阳性病例174份,检出率为3.15%。住院病例检出率明显高于门急诊病例,差异有统计学意义（χ^2=9.432,P〈0.05）;男女之间发病率差异无统计学意义（χ^2=0.848,P〉0.05）;感染发病高峰出现在冬夏两季,各季节发病率差异有统计学意义（χ^2=29.352,P〈0.05）;以41~66岁年龄组检出率最高为4.05%,各年龄段发病率差异有统计学意义（χ^2=5 519.000,P〈0.05）。亚型229E、OC43、NL63和HKU1检出分别为32例（0.58%）、92例（1.67%）、30例（0.54%）和19例（0.34%）,HKU1和OC43同时感染1例,未检测到SARS和MERS亚型。阳性病例中51例发生混合感染,3例为三重感染,48例为二重感染,以混合流感为主。结论 2012-2015年广州地区HCoV流行高峰在冬夏两季,主要感染50岁以上的中老年人,因此要加强中老年人冬夏季节的防护,预防以HCoV感染导致的住院率和混合感染增高。

铜绿假单胞菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因的研究

目的了解广州地区质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因在铜绿假单胞菌中的流行状况并分析其与耐药之间的关系。方法收集2005-2007年临床分离到的212株铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,通过PCR检测质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac(6')-Ib-cr和qepA,并对阳性扩增产物进行DNA测序分析。结果 212株铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为10.8%(23/212)和19.3%(41/212)。qnrB、qnrS和aac(6')-Ib-cr的阳性率分别为0.9%(2/212)、0.5%(1/212)和0.9%(2/212),qnrA、qnrC、qnrD、qepA未检出。4株PMQR基因阳性菌株中,仅1株对左氧氟沙星表现为耐药,其余对环丙沙星和左氧氟沙星均表现为敏感。结论 2005-2007年间广州地区铜绿假单胞菌耐药现象严重,该地区铜绿假单胞菌中已携带有PMQR基因,且敏感菌株中也有该类基因存在。

2009年广州人肠道病毒EV71型分离株重组分析

对人肠道病毒EV71型2009年广州分离株Guangzhou09构建序列系统进化树并分析其重组特点。P1、P2和P3区种系发生进化树提示该分离株发生重组,相似性曲线以及bootscan进一步分析显示该分离株于非结构编码蛋白2B片段区(核苷酸位置4 027bp)处存在EV71亚型C4Shanghai-FJ713137与CVA409-HQ728260型间重组。该分离株与中国大陆目前优势株流行趋势一致,是广州首例发生型间重组且由C4亚型及CVA4型发生重组。

2010-2012年广州地区人冠状病毒及其亚型分布

目的了解2010—2012年广州地区发热呼吸道感染病人的冠状病毒（HCoV）流行状况和特点，为进一步了解人冠状病毒的流行规律及防控奠定基础。方法收集广州市2010—2012年5家哨点医院共3376例符合要求的发热同时伴随有呼吸道感染症状病人的咽拭子标本及相关临床信息，采用Real—timePCR方法检测冠状病毒的核酸并对其进行主要型别鉴定，从人群分布、月份分布及各型别发病率等方面进行分析。结果3376例发热伴有呼吸道感染症状的病例中，55例为冠状病毒阳性标本，检出率为1．63％。亚型0C43、229E和NL63阳性的标本分别为23、13和19例，阳性率分别为0．68％、0．39％和0．56％，其中SARS、HUKl及EMC亚型未检出。冠状病毒流行高峰为1月（5．33％），不同月份之间发病率比较差异有统计学意义（xz=38．197，P〈0．01）；阳性率最高年龄组为60。93岁，检出率为2．6％。亚型OC43发病高峰为12—1月，与其他月份比较差异有统计学意义（xL30．054，P〈0．01），检出率最高的年龄组为60～93岁（1．3％）；229E月分布较为分散，各月份间差异无统计学意义（x：=15．651，P〉0．05），在各年龄组的分布呈不集中趋势；NL63流行高峰为6-9月，与其他月份比较差异有统计学意义（x2=5．801，P〈0．05），检出率最高的年龄组为7～17岁（1．03％）。结论广州市2010—2012年冠状病毒流行高峰为1月份。老年组检出率最高；亚型中OC43阳性率最高，NL63次之，229E亚型阳性率最低；0C43流行高峰为冬季，老年组检出率较高；229E流行高峰及感染人群较为分散；NL63流行高峰为夏季，儿童青少年组检出率最高。

不同等位基因E7/HLA-DR四聚体结合的结核患者CD4＋T细胞CDR3区序列分析

目的 探讨机体抗结核免疫过程中CD4＋T细胞TCR与多肽/MHC之间的识别和结合规律.方法 从9例结核患者胸水中用等位基因不同的结核多肽E7/HLA-DR四聚体磁珠分选出E7结合阳性CD4＋T细胞,提取其RNA逆转录成cDNA作为模板扩增TCRα链和β链CDR3区核酸片段,并比较其长度和序列特征.结果 等位基因不同的E7/HLA-DR四聚体能够识别同一患者CDR3区序列相同或结构功能相似的CD4＋T细胞克隆.结论 结核患者体内CD4＋T细胞识别和结合抗原多肽时有一定的HLA-DR限制性,但是主要以多肽特异性为主,这为进一步探讨机体抗结核免疫中CD4＋T细胞和MHC之间的抗原提呈机制提供了数据.

前列腺癌细胞转移相关基因的筛选

目的通过对si RNA-PSMA-LNCa P、PC-3和LNCa P前列腺癌细胞株进行肿瘤转移基因芯片分析,筛选出与前列腺癌细胞转移相关的基因,并对芯片结果进行验证。方法利用肿瘤转移基因芯片技术,对si RNA-PSMALNCa P细胞株、PC-3细胞株和LNCa P前列腺癌细胞株进行肿瘤转移相关基因表达差异分析,从中筛选出可能调控前列腺癌细胞转移的基因,并利用real-time PCR的方法在前列腺特异膜抗原(PSMA)阳性/阴性的前列腺癌细胞株和临床样品中对筛选得到的基因进行进一步验证。结果从肿瘤转移基因芯片结果筛选得到了3种在PSMA表达抑制或不表达情况下显著上调的基因:MMP3、CDH6和MTSS1;3种基因的表达在PSMA阳性细胞株和PSMA阴性细胞株中与芯片结果一致;利用临床组织对肿瘤转移基因芯片结果验证,结果显示3种前列腺癌细胞转移相关基因的表达水平与前列腺癌临床分级和PSMA的表达呈负相关。结论发现了3种可能参与调控前列腺癌细胞转移的基因:MMP3、CDH6和MTSS1。它们的表达水平与前列腺癌临床分级、PSMA的表达呈负相关,可能参与了由PSMA介导的前列腺癌细胞的转移。

表达结核特异性Vγ9Vδ2 TCR双链单体的果蝇 S2恒定细胞系的构建和鉴定

目的：转染及筛选鉴定能够稳定表达和分泌Vγ9Vδ2 T细胞受体（TCR）双链单体的果蝇S2恒定细胞系。方法利用氯化钙转染法将TCR γ9-FB-pMT／V5-His B质粒、TCR δ2-JB-pMT／V5-His A质粒、pMT／Bip-BirA质粒和pCoHygro潮霉素质粒转染进S2细胞中，用潮霉素B筛选恒定细胞系后表达生物素化的结核特异性Vγ9Vδ2 TCR双链单体，并加以鉴定。结果斑点印迹试验、SDS-PAGE和Western blot表明细胞培养上清中有Vγ9Vδ2 TCR单体，且已被成功生物素化。结论成功筛选出能稳定分泌表达Vγ9Vδ2 TCR的果蝇S2恒定细胞系，为研究γδ T细胞的免疫识别提供实验资料。

bostrycin的抗结核菌活性及对细菌基因表达的影响

目的:探讨bostrycin的抗结核菌活性及其对细菌基因表达的影响。方法:利用纸片扩散法初步鉴定海洋微生物代谢产物的抗结核菌活性。针对有潜在抗结核活性的化合物用绝对浓度间接法测定该化合物抗结核菌的最低抑菌浓度。应用结核cDNA芯片检测化合物处理组与对照组的基因表达谱的变化。结果:初步鉴定发现bostrycin在卡介苗平板上有明显抑菌圈,绝对浓度间接法测定显示醌类化合物bostrycin对卡介苗、结核分枝杆菌H37Rv、结核分枝杆菌临床分离株(包括敏感株和耐药株)均有抑制作用,尤其对耐多药结核分支杆菌有较好抗菌效果。结核cDNA芯片检测提示,在检测的3 875条结核分枝杆菌基因中,bostrycin处理组与对照组比较,有44条差异表达基因,其中18条上调,26条下调;这些差异表达的基因功能涉及核苷酸、脂类、能量、辅酶、碳水化合物的代谢,DNA复制、转录、翻译、氨基酸转运和代谢,细胞膜合成等。结论:本研究为抗结核新药的开发和新的抗结核菌作用靶点的研究提供了有价值的实验基础。

CD277^(+/-)的备选抗原递呈细胞在γδ T细胞识别不同抗原中的限制性递呈作用

目的研究CD277^(+/-)备选抗原递呈细胞(APC)在γδT细胞识别抗原中的限制性递呈作用。方法将流式分选的结核患者胸水或脐带血中的γδT细胞,用CFSE标记后与CD277^(+/-)备选抗原递呈细胞按1∶1比例混合培养,加或不加HMBPP或多肽E7刺激,使用流式细胞术检测γδT细胞增殖情况;以Transwell小室共培养法研究细胞相互接触对其增殖的影响。结果磷酸化抗原HMBPP或结核特异性多肽E7的体外刺激作用下,结核患者胸水和脐带血中的CD277^(+/-)的备选抗原递呈细胞都可引起γδT细胞不同程度的活化增殖,且CD277^+细胞的活化作用强于CD277^-细胞。不同个体来源的单核细胞系的备选APCs相对于淋巴细胞系的备选APCs更容易引起γδT细胞的增殖,其中以CD1a^+CD277^+CD14^-CD1b^-CD1c^-的细胞的抗原递呈效应最为明显,且通过小室实验证实了γδT细胞的增殖过程需与APCs相接触来实现。结论 CD277分子对γδT细胞识别不同抗原有一定限制性递呈作用,需进一步研究相关分子机制从而为γδT细胞的抗结核免疫机制以及相关的免疫治疗提供依据。

2010-2012年广州地区腹泻患者中博卡病毒分子进化分析

目的了解2010-2012年广州地区腹泻患者的博卡病毒的分子变异情况。方法采用普通RT-PCR方法扩增2010-2012年14例人博卡病毒全基因组序列并测序,利用生物信息学软件分别对测序标本的全基因组和编码基因NS1、NP1和VP1/VP2序列进行比对和分析,了解广州地区人博卡病毒的进化变异特征。结果 14例HBo Vs全基因组长约5.2 kb,包含3个开放阅读框(ORF),编码3种蛋白:NS1、NP1、VP1/VP2。其中NS1基因高度保守,VP1/VP2有一些变异,但基于VP1/VP2序列进行的进化分析得到的结果与全基因组分析得到的结果一致。所有14例HBo V病毒株同属于HBo V1型,且没有发生明显的变异。结论2010-2012年广州地区分离到的14例人博卡病毒株同属于HBo V1型,没有发生明显的变异;NS1基因高度保守,VP1/VP2变异率相对较高,且进化分析结果与全基因组进化分析结果一致,可用于监测HBo V的变异。