绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究腺病毒载体绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响，探讨用该载体构建基因修饰BMSCs的可行性。方法在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞免疫表型；293细胞包装制备病毒，以不同滴度的Ad—GFP（1×10^3～1×10^10PFU／ml）转染BMSCs；细胞计数法分析转染率，倒置显微镜观察细胞形态学改变，CCK-8法检测细胞增殖活性；用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导转染Ad—GFP的BMSCs向神经样细胞定向分化。结果3～6代BMSCs表面标志CD34、CIM5阴性而CD29、CD44阳性，当病毒滴度为1×10^7PFU／ml时转染率为55％，为1×10^9及1×10^10PFU／ml转染率均为85％，但1×10^10PFU／ml时出现细胞病理现象，7d荧光表达最强，28d仍可见荧光表达，转染Ad-GFP的BMSCs经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞，神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论合适滴度的Ad—GFP可以高效转染BMSCs，对细胞的生物学特性影响较小，不影响诱导分化功能，BMSCs可以作为Ad—GFP载体系统进行基因治疗的种子细胞。

神经移植的种子细胞:大鼠骨髓基质细胞部分生物学特性

目的:分离培养SD大鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcebls,BM-SCs),观察BMSCs部分生物学特性。方法:实验于2004-03/08在珠江医院广东省神经医学研究所实验室进行。采用密度梯度离心法分离BMSCs,MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞生长周期、鉴定细胞表面标志,免疫荧光染色观察细胞的神经分化功能及端粒酶反转录酶(TERP)表达。PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果:①采用密度梯度离心法可以得到高纯度的BMSCs,表达CD29,CD44等表面标志,而不表达CD31,CD34,CD45。②BMSCs主要由Ⅰ,Ⅱ型两种形态的细胞组成,其中Ⅱ型细胞表达端粒酶活性并可以诱导分化为Nestin阳性细胞。③骨髓基质细胞原代培养时增殖能力较低。结论:BMSCs主要有两种形态和功能不完全相同的细胞类型组成,其中Ⅱ型细胞具有端粒酶活性,并在一定的诱导条件下可以分化为Nestin阳性细胞,可以考虑作为神经移植的种子细胞来源。

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成siRNA的 DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从 mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示:survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测结果显示:survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA 干扰载体pGenesi-1／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响

目的构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用.方法在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-1/survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Westernbloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果实时荧光定量PCR以及Westernblotting检测显示,survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi-l/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.

葡萄球菌蛋白A胶体金分子结构特点及作为原子力显微术标记物的可行性

目的分析葡萄球菌蛋白A胶体金（SPA-CG）分子的特征性构象特点，探讨其作为原子力显微镜观测原位标记物的可行性。方法应用原子力显微镜扫描生理状态下分布在云母表面的葡萄球菌蛋白A胶体金分子，并进行结构分析及理论计算。结果极少数平卧的SPA-CG呈中部球形隆起，两端长短不一的弯曲棒状肽链环抱球形隆起的独特结构，形成反“C”字形结构，球形隆起直径为单个胶体金直径的3～4倍；极少数SPA-CG呈逗号样；绝大多数SPA-CG呈一侧面稍凹的椭球形结构，结构稳定、均一，长径为（40．88±1．58）nm，宽径为（20．82±0．68）n，高度（Z轴）为（10．51±0．28）nm。结论单个胶体金标记的葡萄球菌蛋白A分子具有独特、稳定、均一的特征性构象，可作为原子力显微术观测的原位标记物。

复发性家族性颅内动脉瘤的血管内栓塞治疗(附13例报告)

家族性颅内动脉瘤（familial intracranial aneurysm，FIA）被认为是一种与遗传有关的先天性疾病。与散发颅内动脉瘤相比，FIA破裂率高。随访研究发现，在复发动脉瘤患者中，30％的患者其家族中有一个或多个家族成员出现过动脉瘤性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH），甚至存在2次以上的动脉瘤复发。回顾分析1999年3月至2010年7月，我院神经外科13例复发性FIA的诊治资料，现将结果报道如下。

硬脊膜动静脉瘘的血管内栓塞治疗(附14例报告)

硬脊膜动静脉瘘（spinal dural arteriovenous fistula,SDAVF）起病隐匿,常易误诊致病程延长,早发现并及时治疗预后较好。为了探讨SDAVF的血管内治疗效果,本文回顾性分析2004年1月至2014年2月间于我院行介入栓塞治疗的14例患者,现报道如下。1资料1.1一般资料回顾性分析2004年1月至2014年2月间于我院行血管内栓塞治疗的SDAVF患者14例。其中男12例,女2例,年龄30~71岁,平均（52.3±11.2）岁。

重型颅脑外伤后长期意识障碍患者清醒预测的体感诱发电位分级研究

目的探讨体感诱发电位（SEP）对重型颅脑外伤（TBI）后长期意识障碍患者清醒预测的分级标准。方法记录46例重度TBI后意识障碍超过1周患者的SEP表现，根据SEP中N20-P25是否存在及中枢传导时间（CCT）是否正常，将SEP分为3级：I级为双侧N20-P25都存在（Ia：双侧CCT正常且对称，Ib：双侧CCT正常，但不对称）；Ⅱ级为一侧N20-P25存在．另一侧消失；Ⅱ级为双侧N20-P25都消失。预后以外伤后6个月患者是否清醒为标准。结果SEP分级与清醒的几率存在负相关关系（r=-0．591，P=0．000），分级越高，预后越差。结论SEP的分级可客观、准确地反映脑功能损伤程度和清醒的几率。

体外循环时血氧分压对婴幼儿发绀型先天性心脏病S-100β蛋白与神经元特异性烯醇化酶的影响

目的 对先天性心脏病（CHD）婴幼儿体外循环（CPB）时动脉血氧分压（PaO2）与脑损伤的关系进行前瞻性研究.方法 2010年8月1日至2011年1月31日在广东省人民医院住院的发绀型CHD婴幼儿45例,年龄0～3岁、脉搏血氧饱和度＜85％,随机分为3组：控制组1（G1组）,控制组2（G2组）和非控制组（G3组）,每组15例,在CPB过程中分别全程控制PaO2在80～120 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）、120 ～200 mm Hg和200～ 400 mm Hg.3组患儿除观察因素PaO2外,其他因素基本一致,于CPB前（T1）、CPB刚结束时（T2）以及CPB结束后3、5、24 h（T3,T4,T5）采血检测S-100β蛋白、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和肾上腺髓质素（ADM）.结果 S-100β蛋白在CPB开始后明显升高,以G3组在T2时间点最为明显,高达（699±139） ng/L,显著高于G1组[（528±163） ng/L]和G2组[（585±155）ng/L].对S-100β水平与PaO2进行偏相关分析,结果提示两者呈显著的正相关关系（r =0.526,P＜0.01）.G1组NSE在T3、T4时间点显著升高[（12.2±3.4） μg/L和（ 12.3±3.7）μg/L]；G2组在CPB刚结束时即已有显著升高[（10.9 ±4.8）μg/L],在T3、T4时间点可见进一步升高[ （12.6±5.1）μg/L和（13.2±5.4）μg/L]；G3组在CPB结束时见显著升高,在CPB后24h仍维持在较高水平[（12.2±5.7）μg/L],无明显下降趋势.在同一观察组不同时间点以及同一时间点不同观察组之间ADM差异均无统计学意义.3组患儿均痊愈出院.结论 发绀型CHD患儿CPB过程中高氧灌注可引起S-100β蛋白、NSE血清水平增高,提示PaO2过高可能会引起脑组织损伤加重,并且其损伤程度与组织灌注的PaO2呈正相关.

脑干听觉诱发电位分级对脑创伤长期意识障碍患者清醒预测的价值

目的探讨脑干听觉诱发电位（BAEP）分级标准对脑创伤后长期意识障碍患者清醒预测的价值。方法分析93例脑创伤后长期意识障碍患者的BAEP表现，将BAEP分为3级：Ⅰ级为各波均正常；Ⅲ级为双侧Ⅴ波PL异常、双侧Ⅲ-Ⅴ波IPL异常、单侧或双侧V波消失；Ⅱ级为除Ⅲ级之外的任何异常BAEP表现。以脑创伤后6个月作为判断是否清醒的时间标准。结果Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级的清醒率分别为：79％、18％和0％。分级与清醒差异有统计学意义（r=-0．662，P〈0．001），分级越高，清醒越困难。BAEP分级标准对清醒预测的ROC曲线下面积为0．859，95％可信区间为（0．781—0．937）。结论BAEP分级能客观、准确地反映脑功能损伤程度和预测清醒的概率。

交通事故性重型颅脑损伤院前急救与预后关联分析（附1107例报告）

目的 探讨院前急救在时间环节上对交通事故性罩型颅脑损伤预后的重要性，为我冈相关部门制定预防和控制措施提供参考依据。方法 根据珠江医院神经外科制定的《交通事故性重型颅脑损伤统计表》严格筛选出合格病例，对其相关资料进行统计学分析，主要分析急救接报时间与到达现场时间差的不同时间段以及现场抢救中不同时间段与患者预后的相关性。结果 急救接报到到达现场时间段以及现场抢救时间段与患者预后均存存负相关关系（r_s=-0．10，P=0．002；r_s=-0．06，P=0．034），即随着接报到到达现场时间的增加及随着现场抢救时间的增力加，患者死亡率及致残率逐渐增高，预后越差。结论 通过建立和完善急性颅脑损伤预防和控制中心．科学制定院前急救、转运等各项救治制度，尽量缩短路途耽搁时间及现场抢救时间，提高急救反应速度，可提高救护质量，减少死亡率和致残率。

脑创伤后长期意识障碍患者脑干听觉诱发电位表现与预后清醒的关系

目的 探讨重型创伤性颅脑损伤（TBl）后长期意识障碍患者脑十听觉诱发电位（BAEP）表现与预后清醒的关系。方法 分析63例重型TBI后意识障碍超过2周患者的BAEP表现，主要为BAEP中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波各波峰潜伏期（PL），Ⅰ～Ⅲ、Ⅲ～Ⅴ波峰间潜伏期（LPL）及Ⅰ波与Ⅴ波波幅比。预后以TBI后6个月患者是否清醒为标准，分为清醒组与未清醇组，组间运用两独市样本t检验以筛选出有意义的指标。结果 本组患者清醒率为34．9％（22／63），BAEP指标异常焉夏为66．7％（42／63）。双侧Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波PL，Ⅰ～Ⅲ波、Ⅲ～Ⅴ波IPL及Ⅰ／Ⅴ波幅比均正常的21例中有16例清醒（清醒率为76．2％），双侧Ⅴ波PL异常的8例及双侧Ⅲ～Ⅴ波IPL异常的7例均未清醒．单侧Ⅴ波消失的2例未清醒。清醒组与未清醒组间比较发现双侧差异均有统计学意义的指标为Ⅴ波PL及Ⅲ～Ⅴ波IPL。结论 BAEP的Ⅴ波PL及Ⅲ～Ⅴ波IPL变化可客观、准确地反映脑损伤的程度及预测患者的预后。

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达

目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上：采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定：将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果。结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板；RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达。

骨髓基质干细胞向大鼠脑胶质瘤的趋向迁移作用

目的研究骨髓基质干细胞（BMSCs）向大鼠脑胶质瘤的趋向性。方法在体外分离培养Fisher344大鼠BMSCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型；Transwell法分别将BMSCs、NIH3T3细胞与9L细胞进行共培养．24h后计算细胞迁移率；立体定向法建立Fisher344大鼠／9L细胞脑胶质瘤模型，2周后经神经行为学、MRI、HE染色证实模型成功后，将5-溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）标记的BMSCs、NIH3T3细胞由颈内动脉进行移植，2周后，Fisher344大鼠灌注固定取脑，免疫组织化学检测BMSCs的趋向迁移规律。结果体外分离培养的3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性：BMSCs存体外能够向9L细胞迁移；立体定向法建立Fisher344大鼠／9L细胞脑胶质瘤模型符合胶质瘤的特征：颈内动脉移植的BMSCs也能够向9L细胞胶质瘤趋向迁移，主要分布在肿瘤组织与正常组织的边界。结论BMSCs在体内、外均能够向脑胶质瘤迁移，颈内动脉移植是一种简单、有效的方法。