冬凌草甲素抑制肝癌细胞HepG-2生长的实验研究

目的探讨冬凌草甲素诱导肝癌细胞株HepG-2凋亡的作用及其机制。方法 MTT法检测细胞存活率;Annexin V和PI染色后流式细胞术检测HepG-2细胞凋亡率;Hoechst染色后荧光显微镜观察细胞形态;Western blotting检测MAPK信号通路凋亡相关蛋白的表达。结果冬凌草甲素作用HepG-2细胞24 h后,可剂量依赖性减少细胞存活率,半数抑制率IC50为38.41μmol/L。高、中、低浓度冬凌草甲素处理24 h后的流式结果显示,随浓度增加细胞凋亡率明显增加,HepG-2细胞可见典型的凋亡核改变。Western blotting结果证实冬凌草甲素可降低HepG-2细胞Bcl-2、caspase-9和caspase-3的蛋白表达,增加p-JNK、p-p38、p-p53和活化的caspase-9的蛋白表达。结论冬凌草甲素可诱导肝癌HepG-2细胞凋亡,MAPK信号转导通路凋亡相关蛋白的活化与冬凌草甲素诱导HepG-2细胞凋亡相关。

HRM法检测肿瘤细胞PTEN基因突变实验研究

目的:探索高分辨率熔解曲线(HRM)法检测肿瘤细胞系PTEN基因突变中的应用。方法:采用HRM法初筛肿瘤细胞系PTEN的突变,测序验证HRM筛选结果,TA克隆测序进一步明确突变情况。结果:HRM初筛出Jurkat细胞PTEN基因存在突变,测序结果与HRM结果一致,TA克隆测序确定Jurkat细胞系PTEN基因为缺失突变。结论:HRM法可准确筛选肿瘤细胞系中PTEN基因突变,适于肿瘤细胞PTEN基因突变筛选。

甘草水煎剂中miRNA的提取及其对人外周血单个核细胞的影响研究

目的:分离提取甘草水煎剂中的微小核糖核酸(miRNA),并初步探索其对人外周血单个核细胞(PBMC)的影响。方法:将甘草干燥药材按照常规方法制备水煎剂,浓缩干燥后采用通用植物microRNA快速提取试剂盒提取其中的miRNA,所得miRNA经DNaseⅠ处理后进行电泳鉴定;分别利用甘草水提物、甘草酸、甘草次酸和甘草miRNA处理体外培养的健康人PBMC,24 h后,对各组进行细胞计数,并观察细胞形态学的变化;分别利用antiCD3、anti-CD56、anti-HLA-DR单克隆抗体染色,检测PBMC中不同细胞亚群的变化情况。结果:电泳结果表明,从甘草干燥药材的水煎剂中确实能够提取到miRNA,进一步印证了miRNA的稳定性。对体外培养PBMC作用结果表明,与空白对照组比较,经甘草miRNA刺激的PBMC发生了明显的抱团,细胞数量增多,HLA-DR+细胞的比例显著增加。结论:本实验成功地从甘草干燥药材的水煎剂中提取到了甘草miRNA,甘草miRNA对PBMC的生长具有促进作用,并能显著增加HLA-DR+细胞亚群的比例。

超临界CO_2萃取与水蒸气蒸馏提取疏柔毛变种罗勒挥发油成分的比较研究

目的:比较超临界CO_2萃取法(SFE-CO_2)和水蒸气蒸馏法(SD)提取疏柔毛变种罗勒挥发油化学成分的差异。方法:采用SFE-CO_2法和SD法提取疏柔毛变种罗勒的挥发油,用GC-MS分析鉴定挥发油的化学成分,用归一化法测定各化合物的相对百分含量,比较两种不同方法所提挥发油成分的差异。结果:从SFE-CO_2法提取的挥发油中鉴定了42种成分,从SD法提取的挥发油中鉴定了40种成分,两者共有成分为25种。结论:不同提取方法对疏毛变种罗勒挥发性成分的提取效率不同,在现代化中药制剂生产过程中可采用多种方法联合提取有效成分。

成纤维样滑膜细胞激活在类风湿关节炎中的关键作用及其靶向治疗的研究进展

类风湿关节炎(RA)是临床常见病和多发病,以滑膜组织增生、间质炎性细胞浸润、微血管新生、血管翳形成及软骨和骨组织的破坏等为主要病理特征。目前,其发病机制尚未明确,有越来多研究表明成纤维样滑膜细胞的异常激活在疾病发生、发展中起着关键的作用。靶向成纤维样滑膜细胞的研究策略可为有效治疗RA提供新思路。

Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果。方法利用Survivin启动子替换p EGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体p Sur P-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在p Sur P-EGFP中,构建成重组载体p Sur P-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡。结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果。结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果。

当归补血汤含药血清制备方案

目的探讨小鼠灌胃给予当归补血汤后含药血清的制备方法。方法 MTT法检测骨髓基质细胞体外培养时胎牛血清(FBS)和小鼠血清(MS)的添加比例[FBS∶MS(%∶%)=10∶0,5∶5,10∶5,5∶10,10∶10,0∶10]。小鼠连续灌胃当归补血汤[20 g/(kg·d)]5 d,末次给药(30、60、90、120、150、180 min)后收集血清,利用MTT法检测其促骨髓基质细胞数目增加的能力来确定最佳取血时间。结果当培养体系中小鼠血清和胎牛血清的比例分别是5%时,骨髓基质细胞数目显著高于其他组(P<0.05)。小鼠最后1次给药60 min后,所得血清随取血时间的延长促骨髓基质细胞增加的能力逐渐增强,超过150min后促进效果呈下降趋势。结论培养体系中小鼠血清和胎牛血清的比例会影响骨髓基质细胞体外的生长状态。小鼠末次灌胃给药150 min后所得血清促骨髓基质细胞增加能力最强,当归补血汤药效成分在给药150 min后,在血清中含量最高。

葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对人肝癌Huh7细胞株P38MAPK信号通路的影响

目的研究葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对Huh7肝癌细胞株P38MAPK信号通路的影响和相互关系。方法 MTT法确定含药血清组及各代谢物组给药浓度;荧光定量PCR法检测Huh7细胞P38MAPK信号通路中各基因mRNA转录水平;Western blot法检测Huh7细胞P38MAPK信号通路中各蛋白的表达情况。结果葛根芩连汤含药血清组对P38、JNK的表达有上调作用,对ERK的表达有下调作用;葛根素组对P38、JNK的表达有上调作用,对ERK的表达无影响;大豆苷组对P38的表达有上调作用,对JNK、ERK的表达无影响;大豆苷苷元组对P38的表达无影响,对JNK的表达有上调作用,对ERK的表达有下调作用(P<0.05)。结论葛根芩连汤与葛根素、大豆苷、大豆苷苷元对Huh7P38MAPK信号通路的影响不同,选取葛根芩连汤及其主要代谢物平行研究,更有利于对葛根芩连汤进行深入开发。

不同培养环境对PMBC中Treg和Th17细胞分化的影响

目的:研究不同培养环境对调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)和Th17细胞分化的影响,探索能够逆转肿瘤微环境诱导的免疫耐受的手段。方法:克隆人白介素-6(IL-6)的基因,将其转入表达TGF-β的肿瘤细胞株中,并筛选稳转系;分别收集含或不含IL-6的肿瘤细胞培养上清,制备成条件培养基(Conditioned medium,CM),用于体外培养人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),流式检测PBMC在不同培养环境中Treg和Th17细胞的变化情况。结果:RTPCR分析表明BEL-7402表达TGF-β的水平明显高于Hep G2,因此选择BEL-7402用于制备IL-6的稳转系;ELISA检测结果表明所制备的稳转系能够有效地表达IL-6;流式结果表明,由肿瘤细胞培养上清制备的CM能明显诱导T细胞分化为Treg,而在IL-6存在的情况下则能明显抑制Treg细胞的形成,并促进T细胞分化为Th17细胞。结论:肿瘤细胞培养上清促使PBMC中Treg比例增加;而在其中添加IL-6则能够降低Treg细胞比例,并增加Th17细胞的比例。

银杏叶提取物对叔丁基过氧化氢损伤人脐带间充质干细胞的干预作用

【目的】观察银杏叶提取物EGb761对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）损伤的干预作用。【方法】取原代培养的hUC-MSCs，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖，确定建立氧化应激损伤细胞模型所需的t-BHP浓度以及EGb761的最适作用浓度；采用Annexin V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（FITC/PI）双染流式细胞术测定100 mg/L EGb761对100μmol/L t-BHP所致hUC-MSCs凋亡的影响，同时检测脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化，并采用实时荧光定量PCR观察p53和p21Cip1/Waf1表达水平的改变。【结果】用10～200 mg/L的EGb761预处理3 h可降低hUC-MSCs对100μmol/L t-BHP所致细胞增殖抑制的敏感性，浓度超过100 mg/L后EGb761对hUC-MSCs的保护效果无明显提高；100 mg/L EGb761可显著抑制100μmol/L t-BHP作用6 h后对hUC-MSCs凋亡及其胞内MDA的诱导作用，保持hUC-MSCs内的SOD活性，并显著降低t-BHP损伤的hUC-MSCs内p53和p21Cip1/Waf1的表达。【结论】 EGb761具有保护被氧化应激损伤的hUC-MSCs的作用，其机制可能与p53/p21信号通路的下调有关。

铁刀木DNA提取及其rDNA-ITS序列的分析

目的以核糖体转录间隔区（r DNA-ITS）序列为分子标记,对红木木材铁刀木进行遗传分析,并结合Gen Bank数据库中已有的序列阐明黄檀属、紫檀属、决明属之间及属内的分子系统发育关系。方法通过改良CTAB法对铁刀木边材进行总DNA提取,利用引物对r DNA-ITS序列进行PCR扩增和序列测定,用Mega软件进行系统发育分析,构建红木木材的分子系统发育树。结果用改良CTAB法可以成功提取铁刀木边材总DNA,并在模板稀释倍数为1×102~1×103时可成功PCR扩增出r DNA-ITS序列,片段长度大约为730 bp。结论基于通过r DNA-ITS序列进行序列测定和系统发育树构建的分子生物学方法,可利用ITS序列对红木木材铁刀木进行准确的分子鉴定,为红木的种类鉴定和种间分类提供分子生物学根据。

甲基纤维素沉降对脐带血单个核细胞分离效果的影响

目的研究甲基纤维素沉降预处理对密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞效果的影响。方法取等量的同份脐带血,分别采用Ficoll密度梯度离心一步法和甲基纤维素-Ficoll两步法分离脐带血单个核细胞,倒置显微镜下计数并结合台盼蓝拒染法判定细胞活力,流式细胞术检测其中的造血干细胞以及NK细胞亚群的含量。结果通过2种分离方法分离得到的脐带血单个核细胞的数量、细胞活力和CD34+造血干细胞的含量差异无统计学意义,但通过两步法获得的脐带血CD56+、CD3-CD56dim以及CD3-CD56bright等NK细胞亚群的含量比一步法有明显提高。结论甲基纤维素沉降不影响脐带血单个核细胞的得率、细胞活力以及其中的造血干细胞含量,且较好地保存了脐带血中以CD56分子为主要标志的NK细胞亚群。

Calcein-AM荧光扫描测定细胞毒方法的建立

目的：建立和优化基于钙黄绿素-AM（Calcein-AM）荧光扫描的细胞毒测定方法。方法：首先使用Calcein-AM染色靶细胞,扫描检测Calcein-AM荧光值,确定Calcein-AM最佳激发波长和发射波长;然后优化Calcein-AM染色的浓度和时间;最后以效靶比为30∶1～1∶1,共孵育时间为4 h,荧光扫描测定靶细胞裂解的百分率。结果：荧光染料Calcein-AM能有效标记靶细胞,最佳激发波长和发射波长为485 nm和515 nm;Calcein-AM对细胞毒性低,不影响细胞活性;4 h内的自发释放率低于15%;CIK（Cytokine induced killer）效应细胞与靶细胞共孵育4 h的细胞毒效应随效靶比增加而升高。结论：建立和优化了Calcein-AM荧光染料标记靶细胞检测细胞毒效应的方法,该方法可避免放射性试剂的应用,对细胞毒性低,准确性高。

PBMC与HepG2细胞体外共培养时的相互作用研究

淋巴细胞与肿瘤细胞之间存在着复杂的相互调控和抑制作用,作为细胞分泌的一种囊泡,外泌体(Exosome)能够发挥调控细胞生长和活性的作用。该研究将分离自健康人的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)与肿瘤细胞Hep G2共培养,以检测两者的相互作用以及细胞因子和外泌体的分泌情况。结果表明在一定的范围内肿瘤细胞越多,刺激淋巴细胞分泌IFN-γ的水平越高;流式和激光共聚焦检测显示两者可直接吸附或者通过产生外泌体附着在对方表面;利用两者含有外泌体的培养上清进行交互处理,流式检测表明超过30%的PBMC被肿瘤细胞外泌体所吸附,活化的PBMC更易被肿瘤细胞外泌体吸附,而肿瘤细胞则较少被PBMC外泌体吸附;并且活化的淋巴细胞经肿瘤细胞外泌体处理后,活化程度显著降低,而肿瘤细胞受到淋巴细胞外泌体的影响则较小。这些结果表明淋巴细胞主要通过直接接触发挥作用,而肿瘤细胞则更多地通过外泌体发挥作用,这为更进一步的了解淋巴细胞和肿瘤细胞之间的相互作用机制,制定新的抗肿瘤策略奠定了基础。