生物制药专业本科生《基因工程综合性实验》的改革与探索

为了帮助学生更全面深入地理解和掌握基因工程技术,进一步深化实验教学改革,将《基因工程》、《发酵工艺原理》和《生物技术药物药剂与药代动力学》这三门课程中相互联系比较密切的实验部分进行有机的整合,同时结合我们自己的科研项目,围绕基因工程这一中心,设计了一套较为完善的综合性实验流程,同时对实验的考核方式进行了改革.调查结果表明这一改革取得了较好的效果,为我们在其他实验课程中开展改革提供了有益的借鉴.

淋巴细胞活性检测方法研究

目的探讨淋巴细胞活性检测最佳方法,以提高检测灵敏度和稳定性,降低本底。方法用传统的实验方法和改进的实验方法分别对不同数量的外周血单核细胞进行检测,比较不同实验方法的准确性、灵敏度和稳定性。结果在不吸除培养基的情况下,传统的DMSO和酸性异丙醇都不能完全融解formazan,影响了检测。传统的酸性SDS能够很好的融解formazan,但是得到的OD值太小,这就降低了检测的灵敏度,容易造成测量误差。而改进的10%SDS溶液能够完全融解formazan,并且得到的OD值适中,能够客观的反应细胞数目的变化,减少数值引起的实验误差。结论用改进10%SDS作为溶解formazan的溶解液,可以准确地反应活细胞的数目变化情况,对淋巴细胞这类悬浮细胞来说,在不吸除上清的情况下进行细胞数目的检测更加方便。

TCRVβ7.1基因修饰T细胞对乳腺癌细胞杀伤作用的研究

目的:观察TCRVβ-1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性的影响。方法:脂质体包裹pcDNA3.1Vβ7.1后转染健康人PBMC,流式细胞仪检测pcDNA3.1Vβ7.1基因表达,改良MTT法检测TCRVβ-1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性。结果:TCRVβ-1基因转染可显著增加正常人PBMC该基因表达,转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性有显著性差异。结论:用TCR基因修饰可明显提高正常人PBMC对乳腺癌细胞杀伤作用。

T细胞抗原受体复合体信号转导及其与疾病关系的研究进展

T细胞抗原受体(TCR)是由TCRαβ或TCRγδ组成的异源二聚体,它与CD3分子组成跨膜蛋白复合体结构.抗原在诱导幼稚T细胞或记忆性T细胞进行增殖进而分化成效应细胞时,需要有两个信号刺激,第一信号来自TCR与抗原的特异性结合,第二信号来自抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面的协同刺激因子与T细胞表面相应受体的相互作用.TCR通过胞外部分可变区(V区)的互补决定区(CDR)特异性识别结合抗原;胞内部分在CD3、CD4/CD8和CD28等分子的辅助下,将胞外刺激信号经磷脂酶C(PLC)-γ活化途径和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinaes,MAPK)活化途径传递至胞内,使转录因子活化,这一过程称为T细胞活化的信号转导.而这一过程可使T细胞活化而发挥其生物学作用.TCR/CD3复合体介导的信号转导是T细胞活化并发生抗原特异性免疫反应的重要途径,很多疾病的发生都与其信号转导异常有关,因此更深入地了解T细胞信号转导的分子机制显得尤为重要.本文对TCR介导的信号转导途径作了较为系统地阐述,并简要介绍了其异常与几种重要疾病的关系.……

识别肿瘤相关抗原TCR Vβ基因亚家族表达特征的研究

目的:探讨特异性识别肝癌和不同组织肿瘤相关抗原(TAA)的TCR Vβ基因亚家族的表达特征。方法:用McAb共激活的健康人PBLs,作用于肝癌细胞系BEL-7402和HepG2-2215,以及将不同肿瘤患者PBLs,用RT-PCR、Southern印迹分析TCR Vβ基因亚家族识别癌抗原的优势取用。结果:不同的肝癌细胞系和不同的肝癌患者TCR Vβ7、Vβ15表达较高,而另外两例非肝癌患者TCR Vβ7表达而Vβ15不表达。结论:TCR Vβ7可能是TAA的识别基因,而Vβ15可能为肝癌抗原的识别基因。

核转染技术转染人外周血淋巴细胞效率的初步研究

目的探索核转染技术转染人外周血淋巴细胞的转染效率。方法利用核转染方法将携带增强型绿色荧光蛋白基因的质粒转染人外周血淋巴细胞,24小时后经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白EGFP表达水平,确定转染效率。结果未经任何刺激的外周血淋巴细胞转染效率为8.7%,经抗CD3抗体OKT3和抗CD28抗体共同刺激后的外周血淋巴细胞转染效率为10.5%,经抗CD3抗体OKT3和IL-2共同刺激后的外周血淋巴细胞转染效率为9.9%。结论核转染方法是一种转染人外周血淋巴细胞的有效方法,转染前细胞是否受到刺激激活,对转染的效率影响不大。

肿瘤特异性T细胞受体基因转染诱导记忆性T细胞体外分化的研究

目的探讨肝癌特异性T细胞受体基因转染对记忆性T细胞体外诱导分化的影响。方法以肝癌特异性T细胞受体Vβ7.1转染PBMC,流式细胞术检测目的基因表达。肝癌细胞BEL-7402刺激诱导记忆性T细胞;以流式细胞术检测记忆性T细胞标志性表面分子表达验证记忆性T细胞表型及分化亚群;以AnnexinV-PI双染检测肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测细胞因子IFN-γ分泌探讨记忆性T细胞免疫功能。结果TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达。与PBMC对照组相比,TCRVβ7.1转染组CD45RO表达显著上升。以CD45RA及CCR7表达分析记忆性T细胞亚群显示其表型主要为效应型记忆性T细胞。分化后的记忆性T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率及IFN-γ分泌显著上升。结论肿瘤特异性TCR基因转染可促进以效应型记忆性T细胞(TEM)为主的记忆性T细胞分化,TEM将通过诱导凋亡与分泌细胞因子作用发挥其免疫功能。

恶性肿瘤免疫治疗后淋巴细胞表型及临床疗效的研究

目的:研究免疫治疗和放、化疗对恶性肿瘤患者淋巴细胞表型的影响及其临床疗效的关系。方法:42例晚期肿瘤患者中22例以放、化疗同时输注经共刺激的正常人外周血淋巴细胞(PBLs)进行免疫治疗,每周2次,8次为1疗程。另20例患者作为对照组,仅接受放、化疗。治疗前后用流式细胞仪检测淋巴细胞表型并观察临床症状。结果:放、化疗和免疫综合治疗组患者中15例(68.18％)的淋巴细胞表型明显改善,CD3^+、CD4^+治疗后明显升高,与治疗前比较P<0.05,CD95^+升高,P<0.02,PS评分改善P<0.01;与20例对照组相比,治疗前各项无显著差异,治疗后CD4^+升高,P<0.05,PS评分改善P<0.05;放、化疗联合免疫治疗组病人中有7例(31.82％)的淋巴细胞表型改善不明显,与治疗前及对照组比较,均无显著差异,但PS评分改善,P<0.02;对照组淋巴细胞表型与临床症状改变均不明显。结论:免疫治疗与放化疗联合治疗,可能有利于减轻放化疗的副作用,提高疗效,改善生活质量。

抗CTLA-4单抗阻断肿瘤免疫抑制的研究

目的 :研究抗CTLA -4在淋巴细胞的信号传导和对肝癌细胞 (BEL -740 2 )的杀伤活性。方法 :在淋巴细胞培养体系中加入抗CTLA -4 ,并将淋巴细胞作用BEL -740 2 ,用DNA梯子电泳检测BEL -740 2的凋亡 ,MTT法测淋巴细胞的杀伤活性。结果 :抗CTLA -4能提高淋巴细胞的杀伤活性 ,BEL -740 2出现了凋亡。结论 :抗CTLA -4能够与淋巴细胞表面的CTLA -4分子结合 ,从而阻断CTLA -4的抑制作用 ,提高了T淋巴细胞反应性 ,增强了淋巴细胞对BEL -740 2的杀伤作用 ,能够促进BEL -740 2的凋亡。

hTCRVβ8.4基因修饰T细胞对SCID荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

目的 :探讨经hTCRVβ8.4基因修饰的人外周血淋巴细胞 (PBMC)转输给SCID小鼠的抑瘤作用。方法 :建立荷人肝癌细胞BEL - 74 0 2的SCID小鼠模型 ;用脂质体包裹hTCRVβ8.4基因并转染健康人PBMC ,将此PBMC回输入SCID小鼠体内 ,通过检测瘤重、肿瘤体积大小 ,并计算肿瘤抑制率来观察hTCRVβ8.4基因的抑瘤作用。结果 :回输hTCRVβ8.4修饰的PBMC组 (即实验组 )SCID小鼠的瘤重 :(1 .4 0 2± 0 .81 2 )g ,瘤体大小 :(2 .2 1 8± 1 .5 1 8)cm3 ;未经hTCRVβ8.4基因修饰的PBMC组鼠瘤重 :(2 .94 0± 1 .4 4 1 ) g ,瘤体大小 :(3.5 91± 1 .5 4 6 )cm3 ;注射等体积的生理盐水组鼠瘤重 :(4 .0 1 0± 1 .777) g ,瘤体大小 :(4 .92 7± 4 .5 35 )cm3 ;基因修饰组与PBMC组比较 ,瘤重抑制率 :5 2 .31 %。结论 :hTCRVβ8.4基因能增强PBMC的抑瘤作用 。

复方夏枯草颗粒提取工艺研究

目的:优选复方夏枯草颗粒提取工艺条件。方法:以齐墩果酸含量、总出膏率为指标,采用正交试验设计,优选提取工艺条件;以二甲苯致小鼠耳炎症试验,验证提取工艺合理性。结果:优选提取工艺条件:体积分数为90%的乙醇8倍量,提取2次,每次1.5h。结论:优选工艺可较好的提取复方夏枯草颗粒处方中的有效成分。

Survivin-2B在肿瘤细胞凋亡过程中的作用研究

目的探讨肿瘤细胞凋亡过程中survivin-2B的作用机制。方法通过流式细胞仪分析survivin-2B对肿瘤细胞周期的影响;利用激光共聚焦显微镜观察通过青色荧光蛋白(CFP)标记的survivin-2B和罗丹明123标记的线粒体在细胞内的定位及在细胞凋亡过程中的变化;采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法分析survivin-2B和survivin-ΔEx3在细胞内的相互作用。结果流式细胞仪分析结果表明,Survivin-2B能够明显抑制肿瘤细胞生长,促使细胞凋亡增加;通过激光共聚焦显微镜观察到凋亡早期survivin-2B聚集在细胞发生固缩的部位,且在肿瘤凋亡过程中不存在明显的线粒体定位及与线粒体的相关性;FRET分析显示survivin-2B与survivin-ΔEx3在细胞质中存在很弱的相互作用。结论Survivin-2B能够明显促进肿瘤细胞凋亡,且survivin-2B通过与survivin-ΔEx3直接结合以阻断其抗凋亡效应的可能性较小。

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究

目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。

人类TCRαβ家族V基因的进化研究

目的:了解人类TCRα家族V基因(TCRAV)和TCRβ家族V基因(TCRBV)的进化特征。方法:采用MEGA3.1软件对人类TCRAV和TCRBV基因分别构建进化树,并估算基因复制的发生时间;采用FEL法检测TCRAV和TCRBV编码序列正选择和负选择位点。结果:进化树显示TCRAV和TCRBV的基因分组在进化过程中已经维持了相当长的时间。TCRAV已经不受正选择作用,TCRBV基因序列的CDRs区域检测到两个正选择位点。结论:人类TCRαβ家族V基因的进化特征为研究TCR基因在机体免疫及疾病防治提供了理论分析基础。

TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞体外杀伤及体内靶向识别作用的研究

目的探讨TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞的体外杀伤活性及其在体内靶向识别肝癌细胞的作用。方法①体外实验:以特异性识别肝癌细胞的TCRVβ7.1基因转染健康人外周血单个核细胞(PBMC),转染前和转染后24、48h用流式细胞术检测转染基因的表达。将人肝癌BEL-7402细胞分为4组,其中3组分别与未经修饰的PBMC(PBMC组)、转染pcDNA3.1空质粒的PBMC(空质粒组)、转染TCRVβ7.1基因的PBMC(基因修饰组)共培养,1组作为阴性对照组。共培养前和共培养24、48h,以噻唑蓝(MTT)法检测PBMC对人肝癌BEL-7402细胞的杀伤活性。②体内实验:用重度联合免疫缺陷小鼠建立荷肝癌动物模型,于肿瘤周围皮下注射基因修饰的PBMC,于注射后2、7、14、28、42d各处死2只小鼠,分别取肿瘤、脾、肝、肺、肠、卵巢、心、脑、肾组织,检测基因修饰的PBMC在小鼠体内的存活时间及组织分布情况。结果①体外实验:流式细胞术检测表明TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达。MTT法检测显示,基因修饰组T细胞对肿瘤细胞的杀伤率(24、48h分别为31.24%±2.26%、40.95%±3.45%)明显高于PBMC组(分别为6.92%±3.12%、7.84%±2.29%)和空质粒组(分别为9.23%±2.46%、10.36%±3.34%),差异均有统计学意义(P<0.01)。②体内实验:肿瘤周围注射基因修饰的PBMC后2d,小鼠肿瘤组织已经出现PBMC(8个/视野),随时间延长PBMC数量呈上升趋势,28d达最大值(18个/视野)。取材于不同时间的小鼠组织标本的检测显示,基因修饰的PBMC只分布于肿瘤组织,而在其他组织中没有出现。结论TCRVβ7.1基因修饰可诱导T细胞活化并提高T细胞对肝癌细胞的杀伤活性;外源性TCRVβ7.1基因修饰T细胞在荷肝癌小鼠体内的分布具有肿瘤靶向性。

Hela细胞Survivin克隆及HLA-A2限制性CTL表位预测研究

目的:从Hela细胞中克隆凋亡抑制因子Survivin的编码序列,进行测序,并由此预测其HLA-A*0201限制性CTL表位。方法:设计人Survivin基因序列特异引物,通过RT-PCR扩增Survivin编码序列,构建至pGEM-T载体后,测序分析,并对其进行了HLA-A*0201限制性CTL表位抗原表位相关预测。结果:从Hela细胞中克隆得到的Survivin和Survivin-ΔEx3两种剪接体,其中Survivin-ΔEx3发生1个同义突变和三个错义突变,预测其抗原表位抗原性发生了变化。结论:寻找抗原性强、结合力高的表位,对于今后抗肿瘤多肽疫苗的研究具有重要的意义。

肿瘤抗原活化T细胞体外模型的建立及其免疫效应研究

目的建立体外肿瘤抗原活化T细胞模型,研究活化后T细胞的功能特点与分化方向。方法将肝癌BEL-7402细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)和协同刺激分子抗CD3、CD28单抗共培养(初次刺激组),或与经肝癌细胞刺激的PBMC共培养(再次刺激组),共培养时间分别为24、48、72h。另设靶细胞对照组和PBMC对照组。各组实验均设6孔。以流式细胞仪分析PBMC经肝癌细胞刺激后CD45RO+T细胞比例变化;MTT法检测活化T细胞对肝癌细胞的杀伤率;双抗体夹心ELISA法检测活化T细胞IFN-γ和IL-4分泌水平;流式细胞仪分析T细胞表面Fas配体表达和T细胞受体(TCR)Vβ亚家族表达水平,并比较初次刺激组与再次刺激组T细胞免疫效应的差异。结果健康人PBMC在肿瘤抗原和协同刺激分子作用下,CD45RO+T细胞比例逐渐上升,共培养72h时为(16.1±0.9)%,明显高于PBMC对照组[(2.4±0.3)%,P<0.05]。活化T细胞对肝癌细胞的杀伤率随共培养时间的延长而增大[24h为(28.4±6.7)%、48h为(60.4±6.2)%、72h为(78.0±9.3)%];IFN-γ分泌水平升高,共培养48h时为(932±117)ng/L,明显高于PBMC对照组[(157±30)ng/L,P<0.05];T细胞表面FasL表达增加至(8.1±1.8)%,明显高于PBMC对照组[(0.5±0.2)%,P<0.01];肿瘤抗原刺激后,TCRVβ的表达水平与PBMC对照组相比有所增加。再次刺激组CD45RO+T细胞比例、对肝癌细胞的杀伤率、IFN-γ分泌水平及FasL表达水平均明显高于初次刺激组。结论成功建立了体外肿瘤抗原活化T细胞模型。活化T细胞具有明显的免疫效应,并向Th1和Tc1方向分化;再次接触相同抗原时,其免疫效应更为迅速、强烈,表现出一定的记忆特性。

游离脂肪酸混合物对肝细胞脂毒性及脂代谢相关基因表达的影响

目的:研究游离脂肪酸(FFA)混合物对肝细胞L-02的脂毒性及脂代谢相关基因表达的影响。方法:正常肝细胞L-02分别用正常培养基和0.5、1、2 mmol/LFFA混合物(油酸和软脂酸的比例为2:1)培养24 h后,尼罗红染液室温避光染色,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪确定细胞内脂质堆积情况。组织细胞酶法测定试剂盒测定细胞内甘油三酯含量。MTT法分析细胞存活率,Annexin V-PI凋亡检测试剂盒分析肝细胞的凋亡情况,丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒分别检测培养液中ALT和AST活性。实时定量PCR技术检测脂代谢相关的脂肪分化相关蛋白(ADRP)和固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)的mRNA表达情况。结果:各浓度FFAs混合物均可剂量依赖性增加肝细胞脂肪堆积和肝细胞甘油三酯含量,且1 mmol/LFFA混合物可增高肝细胞的甘油三酯含量2.6倍,与非酒精性脂肪肝病人的变化基本相同。2 mmol/LFFA混合物可降低肝细胞L-02细胞存活率并诱导细胞凋亡,而0.5 mmol/L和1 mmol/LFFA混合物对细胞无明显影响。与对照组相比,各浓度FFA混合物对细胞上清中ALT和AST活性无明显影响。1 mmol/LFFA混合物作用后可分别上调肝细胞的ADRP和SREBP-1 mRNA的表达2.660和2.758倍。结论:FFA混合物可诱导肝细胞L-02脂肪变性且2mmol/LFFA混合物可造成轻度细胞损伤。脂代谢相关基因ADRP和SREBP-1表达上调与FFA混合物诱导的脂肪变性相关。

补血方对环磷酰胺所致小鼠血虚模型的影响

目的:观察补血方对环磷酰胺所致小鼠血虚模型的影响。方法:将小鼠分为空白对照组、补血方组、环磷酰胺组、环磷酰胺+补血方组(补血方低、中、高剂量)。给药后观察外周血常规、细胞周期。结果:补血方可改善因化疗药物环磷酰胺导致的小鼠血虚模型各项指标。结论:补血方对化疗药物环磷酰胺治疗具有良好的辅助作用。

人脐带间充质干细胞培养上清对正常人淋巴细胞各亚群比例的影响

目的:研究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)培养上清对正常人外周血单个核细胞(PBMC)活化、生存及其各淋巴细胞亚群比例的影响。方法:通过密度梯度离心法分离PBMC,加入OKT3刺激,用含有hUC-MSCs培养上清的条件培养基(MSC-CM)处理PBMC,流式细胞术分析比较处理组和对照组各淋巴细胞亚群比例的变化,ELISA法检测MSC-CM对PBMC分泌IFN-γ、IL-10的影响,Annexin V/PI双染确定活化PBMC的凋亡情况。结果:MSC-CM下调了CD4+/CD8+T细胞比值,上调了PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的含量,而对其他淋巴细胞亚群的比例无显著影响;MSC-CM抑制了PBMCs分泌IFN-γ的能力,但对IL-10的分泌有促进作用;此外,MSC-CM对PBMCs有保护作用,降低了PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度。结论:人脐带间充质干细胞的免疫抑制功能可不依赖于与免疫细胞的直接或间接接触,并且与诱导免疫细胞凋亡无关,促进Treg细胞的增殖和活化可能是人脐带间充质干细胞发挥其免疫抑制功能的途径之一。