应用中英文双语讲授药理学实验的调研与体会

通过中英文双语讲授药理学教学实践,总结双语教学中的各种因素对教学效果的影响;旨在探索双语教学的规律和双语教学的意义,分析制约开展双语教学的因素并寻找解决的方法,为药理学双语教学改革的发展与完善提供依据。

一种神经元体外缺氧诱导凋亡模型的建立

目的:在不改变细胞生长环境条件下,建立一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导细胞凋亡模型。方法:取新生鼠培养第8d的皮层神经元,采用不改变原培养基成分,将细胞置于缺氧环境(密闭容器内,抽取成真空并维持30min,然后充95%N2、5%CO2)中分别培养0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0和24h后,于不同时间取出,Hochest33258神经元核染色观察凋亡小体及凋亡细胞核,抽提DNA琼脂糖电泳检测DNA梯形条带,以明确导致皮层神经元凋亡的缺氧时间。结果和结论:缺氧0.5h后即可见DNA梯形条带形成,缺氧1h后即可见神经元细胞核固缩、细胞核凋亡小体形成。在不改变细胞培养基及其它成分的条件下,平均缺氧1h即可诱导体外培养的神经元细胞凋亡,成功地建立起一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导神经元凋亡模型,而且重复性好,可以作为体外缺氧/缺血诱导神经元凋亡的良好平台。

噬菌体随机肽库淘选肺癌细胞NCI-H1299特异性结合多肽

目的利用噬菌体展示肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的20个单克隆中,其中6号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZS6。细胞免疫荧光试验进一步证明,合成的相应多肽FITCZS6对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZS6,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

噬菌体肽库与NCI-H1299细胞筛选肺癌特异性结合多肽ZS-9的初步研究

目的:利用噬菌体肽库与肺癌NCI-H1299细胞筛选出肺癌特异性结合的多肽,研究其亲和力和特异性。方法:以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,与噬菌体随机十二肽库进行三轮筛选,挑取单克隆扩增并测序,进行生物信息学分析、比对;利用ELISA、细胞免疫化学、组织免疫化学方法测定多肽的亲和力和特异性。结果:经过三轮减性筛选发现,随机挑选的9个单克隆中,其中1个对NCI-H1299和A549均具有较高亲和力,将其命名为ZS-9,测序结果为CAT AAT AAG CAT CTT CCG TCT ACG CAG CCT CTT GCG,根据测序结果推导出ZS-9的氨基酸序列HNKHLPSTQPLA,生物信息学分析表明ZS-9的氨基酸序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性,表明我们筛选到一种新的肺癌相关抗原的配体。结论:利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞NCI-H1299和A549具有较高亲和力的多肽ZS-9,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

KIAA0280的亚细胞定位及在缺血脑组织中的表达

目的观察大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中KIAA0280蛋白的表达及亚细胞定位。方法应用免疫组织化学法测定KIAA0280在大鼠急性脑缺血后在缺血与非缺血区表达的差异,利用激光共聚焦扫描显微镜检测KIAA0280的亚细胞定位。结果免疫组织化学结果证实了KIAA0280在大鼠急性局灶性脑缺血后表达的差异,激光共聚焦扫描显微镜证实KIAA0280在大鼠皮层细胞。胶质细胞胞浆和细胞膜上均出现表达。KIAA0280在脑缺血后明显上调表达。结论KIAA0280与蛋白质合成和信号传递有密切关系,为新的脑缺血相关蛋白质,对其功能深入研究将对诊断和治疗脑缺血缺氧疾病奠定基础。

贯叶金丝桃素衍生物GF1029体外抗AD活性及对AD模型大鼠行为学的影响

目的探讨贯叶金丝桃素衍生物GF1029对大鼠原代培养皮层细胞的保护作用及对衰老模型小鼠空间探索能力和脑抗氧化酶的影响。方法采用大鼠原代培养皮层细胞,用MTT法观察GF1029对100 nmol/L H2O2及20μmol/LAβ25-35损伤后的神经细胞的生长情况。用Aβ25-35侧脑室注射联合D-半乳糖腹腔注射的SD大鼠痴呆模型,经GF1029处理后,用Morris水迷宫实验(MWM)检测大鼠学习记忆能力;并取脑测定脑中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。结果 GF1029在40及80μmol/L预处理2 h可减轻对H2O2及Aβ25-35诱导的大鼠皮层神经细胞损伤,GF1029在30、60 mg/kg灌胃可延长模型大鼠的逃避潜伏期(P<0.05),延长平台所在象限的停留时间(P<0.05),和增加跨平台次数(P<0.05),并可提高小鼠脑SOD活性,减少MDA含量(P<0.05)。结论贯叶连翘衍生物GF1029对H2O2及Aβ25-35诱导的大鼠皮层神经细胞损伤有保护作用,并可改善痴呆模型大鼠学习记忆,对抗神经系统衰老,提高脑组织抗氧化能力,抑制脂质过氧化损伤可能是其抗衰老机制之一。

从噬菌体随机肽库中筛选及鉴定肺癌特异性多肽

目的利用Phage display随机肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,并通过ELISA和免疫组化鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行四轮减性筛选,挑取单克隆、扩增纯化噬菌体、并经ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;对阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,多肽标记荧光素FITC,以其在肺癌组织芯片上鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的18个单克隆中,其中3号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZL-3。细胞免疫荧光试验进一步证明,荧光素标记的多肽FITC-ZL-3对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZL-3,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

Ac-HF对Aβ_(1-42)致大鼠皮质原代神经元损伤的保护作用及对α分泌酶活性的影响

目的探讨贯叶金丝桃素乙酸酯(hyperforin acetate,Ac-HF)对β淀粉样肽(Aβ)1-42毒性损伤大鼠原代培养大脑皮层神经元的作用及对α分泌酶活性的影响及可能机制。方法采用大鼠原代培养皮层细胞,用MTT法观察Ac-HF对Aβ1-42毒性损伤后的神经细胞活力的影响。用ELASA检测其对α分泌酶活性及可溶性淀粉样前体蛋白(sAPPα)分泌的影响,应用Western blot检其对淀粉样前体蛋白(APP)及解聚金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinas,ADAM)10表达的影响;并观察Calphostin C(Cal.C)对Ac-HF这些作用的影响。结果 0.1～10.0μmol/L Ac-HF无细胞毒性(P>0.05),1.0～50.0μmol/L Ac-HF可增加Aβ1-42毒性损伤的大鼠皮层神经细胞的活力(P<0.05),0.1～10.0μmol/L Ac-HF可使α分泌酶活性增加,sAPPα分泌增多,对APP蛋白表达无影响,使ADAM10表达增多,PKC抑制剂Calphostin C(Cal.C)可抑制Ac-HF对α分泌酶的活性,sAPPα分泌及ADAM10表达的影响。结论 1.0～10.0μmol/L Ac-HF对Aβ1-42毒性损伤的大鼠皮层神经细胞有保护作用,Ac-HF可通过增加α分泌酶活性及sAPPα分泌产生保护作用,这一作用可能是通过激活PKC通路增加ADAM10表达。

注射用血凝酶对新西兰兔出血时间及凝血功能的影响

目的:探讨注射用血凝酶(立芷雪)发挥止血作用的量效关系。方法:研究不同剂量的立芷雪对新西兰兔出血时间、凝血功能及血液流变学的影响。结果:当立芷雪剂量在0·023、0·07、0·21、0·63KU·kg-1时具有明显的止血作用,但0·63KU·kg-1剂量组作用弱于0·21KU·kg-1组,并且上述4种剂量对纤溶系统未见明显影响;立芷雪剂量达到1·90、5·71KU·kg-1时具有明显的抗凝功效及增加纤溶的作用;各剂量组对血液流变学指标未见显著影响。结论:立芷雪对新西兰兔产生最佳止血作用的剂量可能在0·21～0·63KU·kg-1之间。

肝癌特异性噬菌体多肽的筛选和初步鉴定

目的利用噬菌体展示肽库筛选与肝癌HepG2细胞特异性结合的多肽，为筛选及明确新的肝癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肝癌细胞HepG2为靶细胞，LO-2为吸附细胞，在37℃条件下对噬菌体随机12肽库进行多轮减性筛选，挑取单克隆扩增并鉴定。利用ELISA初步鉴定克隆亲和力，测定阳性克隆DNA测序并进行同源性及氨基酸分析。结果经过3轮减性筛选发现，随机挑选的30个单克隆中，其中ZS-9对HepG2具有较高亲和力，氨基酸测序结果表明，该序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBankDNA序列数据库和SwissProt蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性，而且，国内外文献均未见报道，表明笔者筛选到一新的肝癌相关抗原的配体。结论利用噬菌体随机12肽库成功筛选到与肝癌细胞HepG2具有较高亲和力的多肽，为筛选鉴定新的肝癌特异的标志物奠定工作基础，也为肝癌的早期诊断和靶向治疗进一步研发确定了靶标。

肾癌特异性配体多肽ZT-2筛选及新标志物的研究

目的寻找肾癌早期诊断和靶向治疗的标志物。方法以肾癌细胞株A498为靶细胞，正常肾细胞株HK-2为吸附细胞，37℃下对噬菌体十二肽库进行4轮减性筛选。挑取单克隆采用ELISA方法初步鉴定噬菌体克隆亲和力；阳性克隆提取质粒，测序后合成多肽，鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定，随机挑选20个单克隆中，2号多肽对A498细胞亲和力最高（AZT-2／AN月比值为3．15），命名为Phage-ZT-2。细胞免疫荧光试验证明，合成的相应多肽FITC-ZT-2对A498细胞具有特异性结合。利用荧光标记的ZT-2检测肾癌组织芯片，肾癌组织ZT-2的荧光吸光度（A）值为0．453±0．123，正常组织及非肾癌炎性组织为0．148±0．075，2组间比较差异有统计学意义（t=2．776，P〈0．01）。结论成功筛选出与肾癌细胞特异性结合的多肽ZT-2，为肾癌的早期诊断和靶向治疗提供了实验依据。

乳腺癌干细胞富集及其特异性多肽的筛选

目的:无血清培养法富集乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)并采用噬菌体展示技术,筛选能特异性结合乳腺癌干细胞的噬菌体多肽。方法:无血清培养法富集乳腺癌MDA-MB-231细胞株中干细胞并以此为靶标,以hs578bst人正常乳腺细胞及普通培养的MDA-MB-231细胞为减性筛选细胞,对噬菌体随机肽库进行双重减性筛选,选取富集后的阳性噬菌体单克隆,ELISA及DAB染色鉴定阳性噬菌体特异性并测序。结果:经过3轮筛选,噬菌体得到约500倍的富集,随机挑选10株单克隆噬菌体。ELISA显示,6号噬菌体单克隆对乳腺癌干细胞的亲和力是对照的6.14倍;DAB鉴定亦显示,其对乳腺癌干细胞的特异性及亲和力最高,对阳性噬菌体DNA测序翻译得到十二肽氨基酸为GYSASRSTIPGK。结论:通过干细胞富集及噬菌体展示技术,成功筛选出能够特异性结合乳腺癌干细胞的特异性噬菌体多肽,为乳腺癌的干细胞靶向治疗和深入研究奠定基础。