浅谈如何提高药学专业临床药物治疗学教学质量

临床药物治疗学是研究药物防治疾病的一门实用性很强的综合性学科,也是医学与药学之间的桥梁学科。它的教学要密切结合临床,理论联系实际,摒弃以往沉闷的灌输式、填鸭式教学规程,针对不同的教学内容,采用灵活多样的教学方法将临床知识整合于教学过程中,有助于提高临床药物治疗学教学质量。

肿瘤源性S100A9对食管鳞癌细胞顺铂耐药性的影响

目的研究S100A9是否参与食管鳞癌细胞顺铂耐药过程。方法建立食管鳞癌及其耐药株(KYSE140细胞)。分为Control vector组、vector+cisplatin、S100A9 vector组、S100A9 vector+cisplatin组。Control vector组为细胞转染空白质粒对照,vector+cisplatin组为细胞转染空白质粒对照并加入顺铂处理,S100A9 vector组为细胞转染S100A9质粒,S100A9 vector+cisplatin组为细胞转染S100A9质粒并加入顺铂处理。MTT观察顺铂的细胞毒性。Western blot检测蛋白表达。结果 Western blot结果显示,与单纯的食管鳞癌细胞株相比,S100A9在食管鳞癌耐药细胞中的表达显著增加。MTT结果显示,与顺铂治疗组相比,过表达S100A9可显著降低顺铂的细胞毒性作用(P<0.01);与过表达S100A9组相比,沉默经典的S100A9受体-RAGE受体对过表达S100A9所引起的顺铂细胞毒性降低的效应没有作用(P>0.05)。Western blot结果显示KYSE140细胞中主要表达的NOX亚型是NOX5,此外还有NOX2表达。MTT结果显示,与过表达S100A9的KYSE140细胞相比,NOX抑制剂DPI可显著逆转过表达S100A9所引起的顺铂细胞毒性降低效应(P<0.01)。结论 S100A9可能通过激活NOX通路,介导食管鳞癌细胞顺铂耐药机制。

复方灵尼胶囊系列提取物对环孢素A所致免疫抑制小鼠的影响试验研究

艾滋病是一种全球性流行性疾病，治疗难度很大，虽然西医的哈特疗法取得了很大进展，但全世界至今还未治愈1例，并且单独用西药易产生耐药性。复方灵尼胶囊在仔细分析和总结前人研究工作的基础上，汲取众长，精心挑选了有效成分明确，作用靶点不同的6味常用中药（君药桑白皮，臣药穿心莲和姜黄，佐药黄芪和黄芩，使药甘草）组合而成，从中医角度认为其具有治疗艾滋病的作用，在临床上原以汤剂形式使用，为优化和验证复方灵尼胶囊提取工艺设计的合理性、可靠性和有效性，本课题组旨在考察不同提取工艺制备的提取物对环孢素A诱发的T淋巴细胞亚群抑制小鼠模型的影响，评价其对T淋巴细胞亚群抑制的调节作用，并将系列提取物的功效进行比较，为复方灵尼胶囊提取工艺的确定和优选提供临床前药效学研究依据。

基于大鼠原位肠-肝血管灌流模型研究甘草酸的代谢

目的研究甘草酸在大鼠体内的肠、肝中的生物转化。方法建立大鼠原位肠-肝血管灌流模型,采用LC-MS/MS方法测定灌流液中的甘草酸和甘草次酸。结果甘草酸在单向肠-肝血管灌流模型中稳态肠提取率和稳态肝提取率分别为(4.2±0.6)%和(28.0±3.0)%,灌流液中未发现代谢物甘草次酸;原位循环肠血管灌流模型中甘草酸的一级吸收速率常数为(0.33±0.06)min-1;甘草酸在大鼠十二指肠给药后,灌流液中主要活性代谢产物为甘草次酸,同时肠腔液也存在大量甘草次酸。结论甘草酸的首过效应明显,口服后其主要被肠道菌群或肝细胞代谢,在肠粘膜细胞仅少量代谢。大鼠原位肠-肝血管灌流模型适用于甘草酸的药动学研究。

ERK1/2和p38MAPK介导BAPTA-AM抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化的机制研究

目的探讨BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞能力的影响以及其信号通路机制的研究。方法体外分离培养小鼠骨髓巨噬细胞,建立RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞的实验模型。应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法检测RANKL诱导的小鼠破骨细胞分化和存活的能力及BAPTA-AM对其的抑制作用;采用免疫印迹法(Western blot)测定ERK1/2和p38MAPK蛋白的磷酸化水平。结果 RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞胞质内可见多核,并能分化成为破骨细胞。不同浓度的BAPTA-AM(1、2μmol·L-1)对破骨细胞的形成具有明显的抑制作用,且随着浓度增加能明显地降低TRAP阳性细胞数目。RANKL对小鼠骨髓巨噬细胞的ERK1/2和p38MAPK具有明显的激活作用,诱导胞质ERK1/2和p38MAPK磷酸化,而不同浓度的BAPTA-AM可明显地抑制这种磷酸化作用。结论 BAPTA-AM能明显地抑制RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞,这种抑制作用可能是通过ERK1/2和p38MAPK信号蛋白介导。

基于受体配体结合技术研究酸枣仁镇静催眠活性成分

目的利用受体配体结合法探索酸枣仁中镇静催眠的活性成分,以及该成分的镇静催眠作用机制与苯二氮卓受体的关系。方法首先,对酸枣仁中的化学成分进行乙醇粗提;其次,制备Wistar大鼠脑组织匀浆液;根据受体-配体结合原理,采用体外饱和分子竞争的方法,利用高浓度的地西泮作为阳性竞争药,竞争低浓度的酸枣仁中可与脑组织中苯二氮卓受体结合的配体化合物;收集这些镇静催眠有效化合物,利用HPLC和LC-MS方法对酸枣仁与脑组织孵育提取化合物、地西泮与脑组织孵育提取化合物、地西泮+酸枣仁与脑组织孵育提取化合物进行谱图表征差异性分析鉴定,以确认被地西泮竞争置换出的酸枣仁中的有效镇静催眠化合物。结果 HPLC检测结果显示,与地西泮组、酸枣仁+地西泮组对比,酸枣仁作用组在出峰时间2.71min和46.87min处出现特殊峰。LC-MS检测结果表明,酸枣仁中与苯二氮卓受体结合的配体化合物分别为274.28 m/z、453.34 m/z、496.34 m/z和608.38 m/z,根据酸枣仁指纹图谱的比对这些化合物可能是脂肪酸类物质和三萜类化合物。结论利用受体配体结合技术的原理,结合HPLC和HPLC-MS分析技术研究酸枣仁中镇静催眠活性成分,实验结果发现,酸枣仁中镇静催眠的活性成分可能是脂肪酸类物质棕榈酸(palmitic acid,C_(16)H_(32)O_2)、三萜类化合物麦珠子酸(alphitolic acid,C_(30)H_(48)O_4)和斯皮诺素(spinosin,C_(28)H_(32)O_(15)),这3种化合物由于与地西泮竞争结合苯二氮卓受体,可能具有类似的镇静催眠作用,这为进一步开发新型镇静催眠药奠定了理论基础。

芹菜素对人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响

目的研究芹菜素对人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响。方法应用10~80μmol/L芹菜素处理NCI-H460细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst 33258细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Western blotting检测凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平。结果芹菜素对NCI-H460细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性;芹菜素处理组细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征;NCI-H460细胞凋亡率随着芹菜素浓度增加逐渐增高;芹菜素处理组细胞Bax和caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。结论芹菜素能够抑制人肺癌NCI-H460细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax比值下降,caspase-3活化有关。

芹菜素对人肺癌A549细胞凋亡及相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响

目的研究芹菜素对人肺癌A549细胞增殖抑制和凋亡诱导作用与Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。方法 10～80μmol/L不同浓度芹菜素作用A549细胞,采用MTT法检测芹菜素对A549细胞增殖抑制作用;Hoechst 33258细胞核染色法观察芹菜素诱导细胞凋亡形态学的变化;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的变化。结果 MTT法显示,芹菜素对A549细胞有显著的增殖抑制作用(P<0.01),且具浓度和时间依赖性;荧光显微镜下观察到芹菜素处理组细胞出现典型的凋亡形态学改变:细胞核固缩、染色质凝集和核碎片化等;流式细胞仪分析结果显示,芹菜素呈浓度依赖性诱导A549细胞凋亡;Westernblot结果显示,促凋亡蛋白Bax随着芹菜素浓度升高表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2随着芹菜素浓度升高表达减少。结论芹菜素具有抑制人肺癌A549细胞增殖,诱导其凋亡的作用,其机制可能与上调Bax蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关。

芹菜素对人肺癌NCI-H1299细胞的生长抑制和凋亡诱导的作用

目的研究芹菜素对人肺癌NCI-H1299细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法体外常规培养NCI-H1299细胞,芹菜素作用终浓度分别为10、20、40、80μmol/L。MTT法测定芹菜素对细胞的生长抑制作用;Hoechst 33258细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Western blot方法检测芹菜素对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结果芹菜素能够抑制NCI-H1299细胞的增殖,并随药物浓度的增加、作用时间的延长,作用更明显;Hoechst 33258染色结果显示,芹菜素处理组细胞出现核固缩、染色质凝集和凋亡小体产生等典型的细胞凋亡特征;不同浓度的芹菜素作用24 h,细胞凋亡率逐渐增加,呈一定浓度依赖性;Western blot结果显示,芹菜素处理组细胞Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。结论芹菜素能够抑制人肺癌NCI-H1299细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与调控Bax和Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax比值下降有关。

基于特异性结合多肽ZS-1的肺癌新肿瘤标志物的筛选

目的:利用本实验室已获得的与肺癌特异性结合的十二肽ZS-1(EHMALTYPFRPP)从人类肺癌cDNA文库中筛选出肺癌相关标志物,并进行初步确认,为肺癌的临床早期诊断和靶向治疗奠定基础。方法:本实验以ZS-1为探针,通过将偶联生物素的多肽ZS-1固化在亲和素处理的酶标板,筛选人类肺癌cDNA噬菌体展示文库,经过三轮减性筛选后,挑取与ZS-1特异性结合的噬菌体单克隆、扩增、纯化,再通过PCR技术扩增、产物纯化后,进行DNA测序,测序结果经过生物信息学分析,随后采用组织芯片技术对相关生物大分子进行了检测。结果:通过生物信息学分析首次发现与ZS-1结合的肺癌细胞膜受体蛋白为KIAA1199,随后以KIAA199抗体检测人肺癌组织芯片证实,KIAA1199的阳性检出率为32.8%。结论:从人类肺癌cDNA噬菌体展示文库中筛选出潜在的肺癌肿瘤标志物KIAA1199,为肺癌的早期诊治奠定基础。

大鼠原位肠肝血管灌流模型的优化及完善

目的:对大鼠原位肠肝血管灌流模型的灌流液组成成分进行优化,以获取最佳灌流液配方。方法:对灌流条件进行优化,分别对Krebs-Rin-ger(K-R)液加牛血清白蛋白和甘露醇、K-R液加牛血清白蛋白和右旋糖酐T-40二者进行对比,找出最佳的灌流介质。然后对最佳的灌流介质中牛血清白蛋白的含量进行了优化。结果:K-R液加牛血清白蛋白和右旋糖酐T-40组优于K-R液加牛血清白蛋白和甘露醇组;5%牛血清白蛋白的灌流液是一个较为经济理想的灌流液。结论:在灌流介质中5%牛血清白蛋白是一个较为理想和经济的比例。

大鼠原位肠-肝灌流模型研究小补心汤总黄酮体内效应物质

抗抑郁作用经典古方小补心汤由代赭石、旋复花、竹叶和淡豆豉4味中药组成,含有大量的黄酮类化合物。张有志等研究结果表明,小补心汤乙醇提取物总黄酮（BX-2）具有良好的抗抑郁活性,且BX-2抗抑郁作用的效价强度比小补心汤明显提高,由于BX-2所含成分多,含量低,目前动物体内物质基础研究无法开展,为了研究其体内效应物质基础,本实验尝试用大鼠原位肠肝循环灌流模型对BX-2的体内效应物质基础进行初步研究。

肺癌特异性结合多肽的体外筛选和鉴定

目的应用噬菌体随机肽库技术筛选出与肺癌细胞特异性结合的多肽。方法以人肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,人胚肺细胞MRC-5为吸附细胞,对噬菌体随机12肽库进行3轮全细胞减性筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行ELISA鉴定;对亲和力较高的阳性克隆进行DNA测序并翻译为氨基酸序列;化学合成异硫氰酸荧光素标记的多肽(FITC-ZS-5),采用细胞和组织免疫荧光法鉴定FITC-ZS-5与肺癌细胞的亲和力及特异性。结果通过3轮减性筛选后,与NCI-H1299细胞结合的噬菌体克隆得到有效的富集;ELISA结果显示5号克隆对NCI-H1299细胞亲和力最高,将其命名为Phage ZS-5;测序结果显示Phage ZS-5所表达的多肽序列在国内外均未见报道,细胞及组织免疫荧光实验结果显示FITC-ZS-5对肺癌细胞及组织具有较高的亲和力和特异性。结论应用噬菌体随机肽库技术筛选到肺癌靶向性多肽ZS-5,为肺癌的靶向治疗和诊断奠定基础。

黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响研究

目的研究黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响,为临床肝癌的治疗提供科学的参照。方法选取人的SMMC-7721型肝癌细胞,分别在加入500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM、0μM黄连素的培养液中进行体外培养。于0 h、24 h、48 h、72 h时使用MTT方法对细胞活性进行测定,基于统计学处理方法,分析黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响作用。结果黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞的生长具有显著的抑制作用,且随着作用时间和作用浓度的增加抑制作用呈上升趋势,但黄连素不会影响SMMC-7721人肝癌细胞的复制增殖周期。结论黄连素对能够显著抑制SMMC-7721人肝癌细胞的生长,并诱导细胞的凋亡,作用程度与作用时间和浓度呈正相关,但对细胞的增殖周期没有影响。

HPLC-MS法测定关附甲素及其在Caco-2细胞上的摄取特性

目的建立关附甲素的LC-MS测定法,研究其在Ca-co-2细胞上的摄取特性。方法采用ShimadzuVP–ODS,C8柱,(250mm×2.1 mm,5μm),流动相:乙腈∶水=30∶70(V/V),用0.2%冰乙酸溶液,加入二乙胺适量调pH至4.0左右,流速:0.2 ml.min-1,电喷雾离子化(ES1)方式,采用选择性离子检测法,检测离子为正离子,关附甲素的选择性离子:[M+H],m/z 430。考察温度、药物浓度、时间和pH值对关附甲素在Caco-2细胞上摄取的影响。结果关附甲素在0.2～50.0μmol.L-1的范围内呈良好的线性关系(r=0.9988),最低定量限0.2μmol.L-1。关附甲素在Caeo-2细胞上的摄取具有一定的浓度、时间和pH值依赖性,其摄取表现为被动扩散。结论该法灵敏、简单,专属性强,关附甲素在Caco-2细胞上具有良好的摄取。

辛伐他汀对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡及caspase-9、caspase-3活性的影响

目的:观察辛伐他汀对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞凋亡的影响并探讨其机制。方法:辛伐他汀10,20,30μmol/L作用于NSCLC的A549细胞48,72h后,Hoechst 33 258荧光染色法观察细胞形态学改变,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,分光光度法检测caspase-3、caspase-9活性。结果:不同浓度辛伐他汀作用于A549细胞48,72h后,细胞出现典型的凋亡表现,凋亡率明显增高,呈浓度依赖性,且辛伐他汀10,20μmol/L作用72h后,诱导细胞凋亡的作用更显著。同时,辛伐他汀呈浓度依赖性地增强caspase-3、caspase-9活性;其增强caspase-9活性的作用在72h更显著。结论:辛伐他汀能诱导A549细胞凋亡,该作用与其上调caspase-9、caspase-3活性有关。

紫背天葵提取物降血脂及抗凝实验研究

目的观察紫背天葵提取物的降血脂及抗凝作用。方法以高脂饲料配方(含猪油、胆固醇等)连续饲养小鼠15 d后制备高血脂动物模型,确认模型成功后,以经典水煮醇沉提取方法对紫背天葵提取物进行降血脂、抗凝药理试验。结果紫背天葵高剂量组(15 g/kg)及洛伐他汀均不同程度地降低总胆固醇和甘油三酯水平(P<0.05),其中以降低胆固醇水平作用最为明显,经过抗凝药理实验发现,经灌胃口服给药紫背天葵高剂量组对降低高脂小鼠血脂水平、降低血液黏滞度有较好作用。结论 15 g/kg紫背天葵具有降低胆固醇和甘油三酯、抗凝作用,本研究为开发成辅助降血脂药物奠定基础。

阿托伐他汀通过抑制RhoA活性减少非小细胞肺癌的增殖

目的观察阿托伐他汀(ATV)对非小细胞肺癌(NSCLCs)细胞增殖的影响并探讨其机制。方法用改进MTT法检测不同浓度ATV、RhoA特异性抑制剂C3转移酶(C3 transferase)、RhoA siRNA处理后A549细胞、H358细胞、Calu3细胞的增殖情况。用RhoA活性测定法观察C3 transferase及不同浓度、不同时间ATV处理后NSCLCs细胞的RhoA活性变化。用Lipofectamine2000转染RhoA siRNA,Western blot检测RhoA的蛋白表达。结果 ATV浓度依赖性(0.1～25.0μmol/L)地抑制三株NSCLCs细胞增殖(P<0.05或P<0.01)。ATV浓度依赖性(0.1～25.0μmol/L)和时间依赖性(12～96 h、48～96 h)地抑制不同NSCLCs细胞的RhoA活性(P<0.05或P<0.01)。C3 transferase能显著降低三株NSCLCs细胞的RhoA活性并抑制NSCLCs细胞增殖(P<0.01)。RhoA siRNA在有效沉默RhoA蛋白表达后,也明显抑制NSCLCs细胞增殖(P<0.01)。但ATV联合应用C3 transferase或RhoA siR-NA不能产生协同抑制效应,而与单用C3 transferase或RhoA siRNA的抑制增殖作用相似(P>0.05)。结论 ATV主要通过抑制RhoA活性从而抑制NSCLCs细胞增殖。

克霉唑抗大鼠肝缺血再灌注损伤机制研究

目的研究孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)介导克霉唑抗大鼠肝缺血再灌注损伤作用及其机制。方法 SD大鼠随机分成4组,分别为假手术组、缺血再灌注组、克霉唑低剂量组和克霉唑高剂量组。以谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量及热休克蛋白70(HSP70)蛋白表达等为观察指标,用终浓度分别为25 mg/kg和50 mg/kg的克霉唑预处理大鼠5 d,5 h后观察其对肝缺血再灌注损伤的作用。结果 PXR特异性强诱导剂克霉唑,与假手术组比,能明显诱导CYP3A1基因表达,表现为ALT、AST和LDH显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖性,SOD和GSH-Px活性分别升高,MDA显著降低,对抗氧自由基ROS损伤,上调HSP70表达(P<0.05),表现出强大的抗缺血再灌注损伤作用。结论克霉唑预具有较好抗肝缺血再灌注损伤的保护作用,其机制可能在PXR介导下,拮抗ROS损伤及内源性保护蛋白HSP70表达上调有关。

辛伐他汀对非小细胞肺癌细胞增殖和免疫逃逸的影响

目的观察辛伐他汀对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和免疫逃逸的影响,并探讨其机制。方法用改进MTT法检测不同浓度辛伐他汀、RhoA siRNA处理后A549细胞的增殖情况;用Real-time RTPCR检测抗免疫逃逸相关因子即主要组织相容性复合体Ⅰ类(MHCⅠ,又称HLA-A)和肽转运蛋白(TAP1)的基因表达;用RhoA活性测定法观察RhoA活性变化;用Lipofectamine 2000转染siRNA。结果辛伐他汀能浓度依赖性(10～30μmol/L)地抑制A549细胞增殖,增强HLA-A和TAP1基因表达,抑制RhoA活性(P<0.05或<0.01)。用0.1μmol/L RhoA siRNA抑制RhoA活性后,也能显著抑制A549细胞增殖,增加HLA-A和TAP1基因表达(P<0.01)。但RhoA siRNA联合应用辛伐他汀不能产生协同效应,而与单用RhoA siRNA的作用相似(P>0.05)。结论辛伐他汀主要依赖于抑制A549细胞的RhoA活性,从而增加HLA-A和TAP1表达,减少免疫逃逸和细胞增殖。