乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠模型的生物学特性及病理学研究

目的研究乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠的生物学特性及病理学改变。方法 MMTV-PyMT小鼠饲养于SPF级环境中,观察小鼠的繁育情况。观察小鼠乳腺癌的数目、体积及生存率,研究MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的生物学特性。通过组织病理学切片,观察MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的病理学变化、肺转移情况、细胞增殖和血管形成情况。结果乳腺癌MMTV-PyMT小鼠已经成功繁育9代,共产仔约400只。小鼠乳腺9周即可触摸到肿瘤,并随着周龄的增加,肿瘤的数目逐渐增加,体积逐渐增大,最多可达10个;大部分11周出现肺转移;通常最长生存时间为15周。乳腺癌MMTV-PyMT小鼠为浸润性导管癌,PCNA免疫组化结果显示乳腺癌有较多的增殖细胞;vWF结果表明乳腺癌有明显的新生血管。结论乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠已被成功保种和扩群,可稳定自发性乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的经典动物模型。

APC^(Min/+)结直肠癌癌前病变小鼠模型的生物学特性

目的研究C57BL/6J-APCMin/+小鼠肠道腺瘤的生物学特性。方法记录APCMin/+小鼠的繁育情况,通过统计不同周龄小鼠小肠及大肠腺瘤的数目和总体积,观察其肠道腺瘤的发生、发展规律;通过病理组织学切片,观察腺瘤的病理学变化;通过免疫组织化学染色,观察WNT信号通路相关基因的表达情况。结果 APCMin/+小鼠9周龄时肠道开始有腺瘤发生,24周龄时多数小鼠出现死亡。从9~24周龄,腺瘤体积持续增大,但小肠腺瘤数目不再增加。免疫组化染色显示腺瘤中β-catenin入核,启动WNT信号通路下游原癌基因cyclinD1活化。结论 APCMin/+小鼠是良好的结直肠癌前病变动物模型。

Rip1-Tag2转基因小鼠模型的生物学特性

目的研究胰腺癌Rip1-Tag2小鼠饲养管理及生物学特性。方法 Rip1-Tag2转基因小鼠饲养于SPF级环境中,记录小鼠的繁育情况。通过计数血性胰岛及肿瘤的数目,并测量肿瘤的体积,观察Rip1-Tag2小鼠肿瘤发生发展情况。通过组织病理学切片,观察Rip1-Tag2小鼠胰腺癌的病理学变化。结果 Rip1-Tag2小鼠已经成功繁育10代,共产仔620只。Rip1-Tag2小鼠肿瘤发生发展具有明显的阶段性:约6周出现血性胰岛,约8周出现肿瘤,并随着小鼠周龄的增加,肿瘤的数目和体积逐渐增多和增大。结论 Rip1-Tag2小鼠已被成功保种和扩群,具有较强的繁殖和适应能力,可稳定自发胰腺肿瘤,可作为研究肿瘤发生发展的经典动物模型。

卡红染色法在鸡胚早期血管发育研究中的应用

目的探讨卡红染色在鸡胚原肠期血管发育研究中的应用。方法种蛋置于恒温培养箱进行孵化,分别取不同时段鸡原肠胚,经4%多聚甲醛固定,硼砂卡红溶液染色后,体式显微镜下观察。结果鸡原肠期的胚体及外周的血岛呈鲜红色,可相继观察到原条、脊索、神经管及体节的发生过程,血岛的出现及其变化过程。结论能更早、更直观地观察到鸡胚早期血管发生的变化过程;此法简单易行,可用于对胚胎发育及血管发生等影响因子的筛选和研究。

黄连素调节鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇信号通路抗糖尿病小鼠肾损伤的研究

目的研究黄连素对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠肾损伤的保护作用及其对糖尿病小鼠肾脏鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇(SphK-S1P)信号通路的抑制效应。方法四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠采用黄连素(300 mg.kg-1.d-1)灌胃给药12周,正常组和糖尿病组小鼠给予同体积的溶媒。采用Re-al-time PCR技术检测肾组织中SphK1、TGF-β1、FN、ColⅣ的基因;Western blot法检测肾脏组织中SphK1、FN、ColⅣ的蛋白表达;LC-MS/MS检测肾脏组织中SphK1活性和S1P含量。结果黄连素明显抑制糖尿病小鼠血糖,肾重/体重比、血尿素氮、血肌酐和24 h尿蛋白异常增高;抑制肾脏肥大、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原积聚。此外,黄连素明显减少肾脏SphK1活性、mRNA和蛋白表达,降低S1P的生成。结论黄连素发挥抗糖尿病小鼠肾损伤的作用可能与抑制肾脏SphK-S1P信号通路的激活相关联。

SphK1-S1P信号通路的激活参与糖尿病大鼠肾损伤的研究

目的观察鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信号通路在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏中的激活情况。方法观察STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路的激活情况。分别检测大鼠肾脏功能及病理指标。采用液质联用分析SphK1活性及S1P含量。并采用免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot法检测了SphK1的表达。结果 STZ诱导的糖尿病大鼠血糖、肾重体质量比、24h尿蛋白显著升高,糖尿病大鼠肾脏系膜区肥大,细胞外基质扩展。同时,糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路被激活,表现为SphK1表达和活性增加,以及S1P生成增加。结论糖尿病大鼠肾脏中存在SphK1-S1P信号通路的激活,可能参与了糖尿病大鼠肾损伤过程。

栀子苷改善CCl_4引起的小鼠肝纤维化损伤的实验研究

目的研究栀子苷的抗肝纤维化药理作用。方法雄性C57小鼠采用腹腔注射CCl4构建肝纤维化模型,同时采用栀子苷进行灌胃给药干预。运用HE染色和天狼星红染色检测肝纤维化的变化;生化检测血清丙氨酸转移酶(ALT)和天冬氨酸转移酶(AST)以及肝组织的羟脯氨酸含量。Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)及α-SMA的蛋白表达。结果栀子苷显著抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化程度。与纤维化模型组相比,栀子苷治疗组血清ALT、AST水平及肝脏组织中羟脯氨酸水平明显降低(P<0.01)。栀子苷显著抑制肝组织中TGF-β1和α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论栀子苷具有显著的改善肝纤维化作用。

穿心莲内酯滴丸抗小鼠黑色素瘤作用的研究

目的研究穿心莲内酯滴丸的抗肿瘤作用。方法采用C57BL/6小鼠作为实验动物于右腋下皮下接种小鼠黑色素瘤细胞B16,建立小鼠B16皮下移植瘤模型,用穿心莲内酯滴丸(0.143 mg.20 g-1)和对照药物氢化穿心莲内酯滴丸(0.143 mg.20 g-1)灌胃治疗,观察肿瘤体积、肿瘤质量、小鼠生存率的变化,分析穿心莲内酯滴丸对肿瘤发生发展的影响;用免疫组化法测定肿瘤细胞的增殖指数。结果与对照组相比,穿心莲内酯滴丸处理的皮下移植瘤模型的小鼠肿瘤体积和肿瘤质量明显减小,生存期明显延长,细胞增殖指数明显低于对照组。结论穿心莲内酯滴丸能够抑制肿瘤细胞的增殖,从而抑制小鼠B16皮下移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,具有一定的抗肿瘤作用。

血小板上表达的P-选择素对B16细胞分泌肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子的影响

目的探讨血小板上表达的P-选择素对B16细胞分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响。方法将B16细胞分别与C57小鼠和P-选择素敲除小鼠的血小板共培养,用ELISA法检测上清中的肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子的浓度。结果 B16细胞与C57小鼠的血小板共培养的血清中血管内皮生长因子的浓度明显高于与P-选择素敲除小鼠的血小板共培养的血清中的浓度,差异有统计学意义(P<0.05),而肿瘤坏死因子的浓度差异无统计学意义。结论血小板上表达的P-选择素促进了B16细胞分泌血管内皮生长因子,但对肿瘤坏死因子的分泌则没有影响。

改良CAM移植瘤模型的制备及其对肿瘤血管新生抑制药物的筛选效果

目的：以改良方法在鸡胚绒膜尿囊膜（chickchorioallantoicmembrane，CAM）上接种人成神经胶质瘤U87细胞制备移植瘤，验证改良模型筛选抗肿瘤血管新生药物的有效性和可行性。方法：将鸡胚种蛋随机分为2组，分别使用传统方法与改良方法建立CAM-U87移植瘤模型；改良方法在鸡胚孵育中增加9—16h的开窗适应期，再将特制的硅胶圈放置在CAM组织-级血管的半侧；硅胶圈内接种U87细胞建立CAM—U87移植瘤模型。模型的硅胶圈内分别加入经典抗血管新生药物沙利度胺（50、100、200μg／ml）和自主研发抗血管新药G386，以DMSO为对照；体视显微镜观察肿瘤形态，H—E染色法观察瘤组织新生微血管密度（microvesseldensity，MVO），原位杂交（insituhybridization，ISH）技术检测血管标记物VEGFR2的表达。结果：成功制备改良CAM—U87细胞移植瘤，改良模型不影响CAM本身的血管生成，其瘤细胞接种成功率较传统模型显著升高[（70．00±4．226）％vs（41．25±5．154）％；t=4．314，P=0．0007]，移植瘤体积显著增大[（60．20±6．012）vs（15．97±2．403）mm3；t=6．012，P〈0．0001]。沙利度胺和G386两药均能显著抑制移植瘤组织中的血管形成，使瘤组织中MVD显著降低[沙利度胺200μg／ml时（15．85±1．15）％vs（29．80±4．16）％；t=2．49，P=0．0474]、VEGFR2表达明显减少。结论：改良方法成功制备CAM—U87移植瘤模型，经沙利度胺和G386验证，该模型对抗肿瘤血管新生药物的筛选具有良好的有效性和可行性。

穿心莲内酯通过Caspase-3/PARP途径诱导人舌癌Tb细胞凋亡作用研究

研究穿心莲内酯对舌癌细胞(Tb细胞)凋亡的作用及其机制。用瑞士吉姆萨染色法、Hoechst 33258荧光染色法、原位Annexin V/PI双染和流式细胞术检测穿心莲内酯对Tb细胞凋亡的作用;Western blot检测穿心莲内酯诱导Tb细胞凋亡的机制。结果显示:穿心莲内酯处理Tb细胞后,与对照组相比,细胞凋亡数明显增加(P<0.05)。Western blot实验结果发现,穿心莲内酯处理组与对照组相比,聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(polyADP-ribosepolymerase,PARP)表达明显增强(P<0.05),表明穿心莲内酯可能通过活化PARP促进Tb细胞的凋亡。

P-选择素在基因敲除小鼠肺转移中的作用研究

目的探讨P-选择素对小鼠黑色素瘤肺转移的影响。方法将体外培养的B16黑色素细胞株通过小鼠的尾静脉注射到小鼠背景为C57/BL(C57)的P-选择素敲除的小鼠和C57小鼠的体内,建立转移瘤瘤模型,第21天断颈处死小鼠,计数转移到肺表面的结节的数目,HE染色进一步确定转移结节。结果 P-选择素敲除小鼠肺表面转移的肿瘤结节的数目明显比C57小鼠少,两者比较差异有统计学意义(P﹤0.01)。HE染色证实小鼠肺组织中有B16细胞的肺转移灶。结论 P-选择素缺失可能参与抑制了黑色素瘤的肺转移。

结直肠癌有无肝转移血清差异蛋白质表达的研究

目的:利用蛋白质组学技术分离、鉴定结直肠癌有无肝转移患者血清中差异蛋白质,筛选诊断肝转移的血清蛋白标志物。方法:根据入组条件,收集结直肠癌无肝转移病例、有肝转移病例,在两组中随机抽取12例血清样本,同组血清等量混合进行双向凝胶电泳,建立两组血清蛋白质双向电泳图谱,用Image-Master V5.0软件寻找两组差异蛋白质点,MALDI-TOF-MS对差异蛋白质进行鉴定,查询生物信息数据库对差异蛋白质进行初步分析。结果:两组比较差异在2倍以上蛋白质有8种,其中5个蛋白质表达上调,3个蛋白质表达下调;两组每个差异蛋白灰度体平均值比较差异均有统计学意义(P<0.05)。通过数据库搜索鉴定出7种蛋白质,上调的5个蛋白质分别是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase(RNA指导的DNA合成酶)、Conserved hypothetical-protein(假定蛋白质)、SEC14L1 7 kDa protein;下调的2个蛋白质分别是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。结论:结直肠癌有无肝转移患者血清中的蛋白质表达谱有一定的差异性,这些差异蛋白质可能成为诊断肝转移的血清标志物。

靶向NF-κB信号通路的胰腺癌治疗研究进展

胰腺癌是一种胰腺原发恶性肿瘤疾病。由于其早期的症状较少,患者确诊时往往病情已较为严重,并且预后较差,1年及5年生存率都较低,是威胁人类健康的重大疾病。NF-κB(核因子κB)是广泛表达于各类动物细胞中的转录因子,在免疫应激中扮演重要角色,其异常表达可导致免疫系统异常疾病及肿瘤的发生。本文对NF-κB信号在胰腺肿瘤治疗中的应用与前景作一综述。

命运分子cNumb在原肠期胚胎的表达及其生物信息学分析

目的探讨命运分子c Numb在原肠期胚胎中的表达情况及其基因和编码蛋白的基本生物学特征。方法利用原位杂交技术检测c Numb基因在原肠期鸡胚中的表达情况,同时应用生物学软件和在线平台对c Numb基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果 c Numb mRNA在鸡胚4期开始表达于原条顶端,随发育过程逐渐扩展至亨氏节、头突和神经管,但表达区域仍相对集中。Numb基因在不同物种中具有较高保守性,c Numb编码的蛋白属于胞内蛋白,包含磷酸酪氨酸相互作用结构域和多个潜在磷酸化位点,可参与调节多种细胞生物学过程。结论通过生物信息学分析获得了c Numb基因及其蛋白的生物学特征,为进一步研究Numb在胚胎神经发育中的调控机制奠定了基础。

Cyclin D1调控U87胶质瘤细胞周期研究

目的探讨细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)在U87胶质瘤细胞周期调控中的作用。方法根据NCBIGenBank中cyclin D1序列设计双链siRNA,利用Western blotting技术验证设计的siRNA序列的有效性,并通过流式细胞术检测抑制CCND1对U87胶质瘤细胞周期进程的影响。结果经Western blotting检测,成功抑制了CCND1的表达。并且抑制CCND1后,U87细胞周期停滞在G1期,抑制了U87细胞的G1/S期转换。结论 U87细胞中抑制CCND1可以显著抑制细胞周期进程,使细胞周期停滞在G0/G1期,为进一步研究胶质瘤的靶向治疗奠定了理论基础。

虎杖苷抑制肝星状细胞活化研究

目的:研究虎杖苷的抗肝纤维化药理作用。方法:采用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激人肝星状细胞株(LX-2)诱导肝纤维化细胞模型,采用虎杖苷(20μM)进行干预。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:虎杖苷能显著抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞α-SMA的表达。结论:虎杖苷具有显著改善肝纤维化的作用,有望成为新型的抗肝纤维化药物。

cyclin D3调控LN308胶质瘤细胞迁移研究

目的探讨细胞周期蛋白D3(CCND3)在LN308胶质瘤细胞中的作用。方法根据NCBI GenBank中cyclin D3序列设计双链siRNA,利用western blotting技术验证设计的siRNA序列的有效性,并通过流式细胞术检测抑制CCND3对LN308胶质瘤细胞周期进程的影响;通过transwell检测CCND3对LN308细胞迁移的影响。结果经western blotting检测,成功抑制了CCND3的表达。并且发现与对照组相比较,抑制CCND3表达对LN308细胞周期无影响,但是可以显著抑制LN308细胞的迁移。结论 LN308细胞中CCND3并不发挥调控细胞周期的功能,而是影响细胞的迁移,促进肿瘤的发展。本研究为临床上靶向治疗胶质瘤提供了理论基础。

检测生物样品中SphK1活性的LC-MS/MS分析方法的建立

目的建立并确证一种快速、灵敏、高效的测定生物样品中SphK1活性的液质联用(LC-MS/MS)分析方法。方法采用C17-Sph作为底物,通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性进行体外酶促反应。终止反应后,生物样品经液-液萃取,真空干燥,复溶,进行LC-MS/MS分析。通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性。结果 C17-S1P标准曲线的线性范围为10～1 000 ng mL-1,相关系数r2>0.998,最低检测限(LLOQ)为10 ng mL-1。HEK293细胞转染了野生型SphK(SphKWT)后,SphK1活性显著增加。相反HEK293细胞转染了突变型SphK(SphKG82D)后,SphK1活性接近正常水平。结论该方法能够灵敏快速地测量SphK1活性,为研究SphK1信号通路及其相应靶标药物提供了有效的分析手段。

外源基因转染血管内皮细胞条件优化

目的探讨阳离子脂质体及电穿孔法介导外源基因转染血管内皮细胞的转染效率并进行条件优化。方法采用绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectamine^(TM)2000阳离子脂质体为载体以及电穿孔方法,转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)。培养48 h后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在HUVEC内的表达及转染效率。结果 Lipofectamine^(TM)2000阳离子脂质体介导组有少量细胞可见弱荧光信号,而电穿孔法转染组可见较强荧光信号,其中以电击条件为电场强度1100 V、脉冲时间20 ms、电击2次的转染效率最好。结论电穿孔法介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,可作为血管内皮细胞的外源基因转染的方法。