药用植物次生代谢在中药材生态种植中的作用及利用

该文综述了生态种植对次生代谢的影响,指出生态种植能提高植物次生代谢产物的含量,尤其是具有防御作用的次生代谢产物的含量,并分析了其可能的机制。然后从开展病虫害草生物防控、促进有益微生物积累、优化混合种植、调控免耕及秸秆覆盖等角度总结了中药材生态种植中次生代谢的诱导和利用。文章指出高度关注次生代谢是中药生态农业最重要的特征,生态种植能促进中药材次生代谢产物的积累(即提升中药材品质)、有利于病虫草害的防控等,对于生态种植能提高药用植物次生代谢产物含量的研究还缺乏系统性,其影响和机制还亟待在中药材的生态种植上开展广泛验证和系统深入研究。

新疆紫草中2条CYP450基因的干扰毛状根体系的建立及其影响研究

该研究依托新疆紫草悬浮细胞转录组数据库,以CYP76B74蛋白序列为搜索序列,挖掘了2条与紫草素生物合成下游途径相关的CYP450候选基因。构建了候选基因的干扰型毛状根并进行培养,测定了鲜重、干重、总萘醌含量、紫草素类化合物含量以及紫草素生物合成途径关键酶基因的表达量,初步探究了候选基因对新疆紫草毛状根的生长和紫草素合成产生的影响,并讨论了其影响紫草素合成的可能调控机制。通过本地Blast和系统发育分析,筛选出2条新疆紫草中与CYP76B74具有高同源性的CYP450候选基因(CYP76B75,CYP76B100),并构建了相应的干扰型毛状根。相比空载毛状根(RNAi-control),CYP76B75被干扰毛状根(RNAi-CYP76B75)和CYP76B100被干扰毛状根(RNAi-CYP76B100)的鲜重显著减少,而干重未受到影响,折干率显著增加。除β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁在3组毛状根中含量都很高外,紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异丁酰紫草素以及总萘醌在3组毛状根中的含量高低均呈现一致规律:RNAi-CYP76B75>RNAi-CYP76B100>RNAi-control。其中,干扰CYP76B75表达后对β-羟基异戊酰紫草素合成的促进作用最显著,RNAi-CYP76B75中β-羟基异戊酰紫草素的含量为RNAi-control的11.7倍。实时荧光定量PCR结果显示,与RNAi-control相比较,RNAi-CYP76B75与RNAi-CYP76B100中AePGT基因的表达量无明显变化,CYP76B74与AeHMGR的表达量上调;此外,RNAi-CYP76B75中,CYP76B100的表达量下调,而RNAi-CYP76B100中,CYP76B75的表达量反而显著上调。结果说明CYP76B75与CYP76B100被干扰表达后,毛状根的生长受到了抑制,但却显著促进了其紫草素的合成,其可能通过上调新疆紫草毛状根中CYP76B74基因的表达量调控了紫草素生物合成。

新疆紫草咖啡酸及迷迭香酸糖基转移酶的克隆及功能研究

咖啡酸及其衍生物是传统中药材紫草的重要水溶性有效成分,具有抗菌、抗氧化、保护心脑血管、抗肝纤维化和保肝、抗病毒及抗肿瘤等多种生物学活性。由于该类化合物经苯丙烷途径合成,而UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)对苯丙烷途径的调控发挥重要作用,因此推测紫草细胞中存在糖基转移酶参与咖啡酸或/和其衍生物的修饰。该研究通过挖掘新疆紫草Arnebia euchroma转录组数据克隆获得15条糖基转移酶候选基因全长,并通过原核表达检测了对咖啡酸及迷迭香酸的体外活性。结果表明AeUGT_01,AeUGT_02,AeUGT_03,AeUGT_04,AeUGT_10可催化咖啡酸或/和迷迭香酸生成1~3种糖基化产物。这些糖基转移酶处于不同的系统进化分支,与同分支其他糖基转移酶具有底物或催化功能的相似性。因此推测糖基转移酶不同分支通过独立进化不断扩张而产生了趋同进化现象,糖基转移酶的底物宽泛性是这一现象产生的基础。上述工作为进一步研究新疆紫草咖啡酸及迷迭香酸糖基转移酶体内功能奠定了基础,有助于明确咖啡酸衍生物的形成及调控机制;也为咖啡酸及迷迭香酸的糖基化修饰提供了工具酶。

新疆紫草羧基-辅酶A连接酶(AeCCLs)的全长克隆及功能验证

羧基辅酶A连接酶(carboxyl CoA ligases, CCLs)是腺苷酸合成酶基因家族的一个重要分支,主要存在2步催化反应,在三磷酸腺苷的存在下能够可逆的催化不同结构的羧酸盐焦磷酸化形成相应的酰基-单磷酸腺苷中间体;辅酶A或其他酰基受体的硫醇基中的自由电子通过亲核攻击取代单磷酸腺苷形成相应的硫酯。该文以新疆紫草Arnebia euchroma作为研究材料,基于前期转录组数据,筛选到2条AeCCLs基因,命名为AeCCL5(XP019237476.1)和AeCCL7(XP019237476.1),生物信息学分析推测相对分子质量分别为60.569 kDa和60.928 kDa,理论等电点(theoretical pI)分别为8.59和8.92,不稳定系数(instability index)分别为36.78和39.27,存在跨膜结构域,不存在信号肽。通过多序列比对及进化树分析发现,AeCCLs与其他植物的同源蛋白序列相似性不高,这类酶的底物结合位点不是高度保守的,可能是在进化过程中,序列和结构可以适应新底物的变化而变化。该研究首次将AeCCL5和AeCCL7基因全长克隆到表达载体pCDFDuet-1上,原核表达带有His标签的AeCCL5和AeCCCL7蛋白,并通过镍柱纯化得到AeCCL5和AeCCL7的纯化蛋白,通过体外酶促反应证明了AeCCL5和AeCCL7均可参与紫草素生物合成的上游苯丙烷代谢途径,催化4-香豆酸生成4-香豆酰-辅酶A,进而合成紫草素类化合物生物合成的重要前体之一——对羟基苯甲酸。