五谷虫抑菌活性多肽RP-HPLC分离与纯化方法研究

旨在建立一种五谷虫抑菌活性多肽分离纯化的方法,为研究其药用价值提供实验依据。通过匀浆、过滤、加热、离心后利用超滤膜超滤获得分子量在30 ku以下的蛋白多肽,采用凝胶过滤层析系统初步分离并筛选出抑菌活性峰,以RP-HPLC建立该活性峰的分离纯化方法。结果显示,凝胶过滤层析法分离并且筛选出两个具有抑菌活性组分S2和S3;RP-HPLC色谱法确定了S2具有7个峰和S3具有4个峰;该方法稳定性、精密度、重复性实验的保留时间与峰面积的RSD值均小于5%;6批样品RP-HPLC图谱相似度值大于0.99;采用RPHPLC能快速分离五谷虫抑菌活性多肽,且该方法稳定、可靠、重复性好。

蛹虫草液体发酵过程主要活性成分的代谢变化

目的:研究蛹虫草在液体发酵过程中主要活性成分的累积与代谢变化。方法:选取蛹虫草菌种GIM5.270,在基本发酵条件下延长发酵时间至20 d,通过含量分析方法检测每24 h时间间隔后生物量、虫草多糖、虫草酸、腺苷、虫草素在发酵体系中的累积与动态变化。结果:复合氮源组成的基础培养基比单一氮源组成所产生的生物量更高,随着时间发展,菌丝体生物量越来越高,虫草多糖与虫草酸(D-甘露醇)先增高后降低,腺苷逐渐降低,虫草素(3-脱氧腺苷)逐渐增高。结论:随着时间的发展,整个体系会吸收自身产生的营养物质出现自溶现象,本研究探索了主要活性成分在发酵体系中的代谢变化,确定了主要活性成分的最佳收集时间,为提高活性成分的产率提供依据。

蝇蛆抗氧化肽的制备及其纯化

以DPPH自由基清除率为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化碱性蛋白酶水解蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。采用超滤、Sephadex G25凝胶过滤层析对蝇蛆蛋白水解物进行分离纯化,筛选高抗氧化活性组分。结果表明,酶法制备蝇蛆蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件为：加酶量7000 U/g,底物质量浓度1%,酶解时间15 min,酶解温度50℃,p H值7.5。水解物经超滤得到相对分子量大于10 k D、5~10 k D以及小于5 k D的组分,以小于5 k D组分清除DPPH自由基活性最强。该组分通过凝胶过滤层析进一步分离得到2个组分,其中组分Ⅱ的清除DPPH活性明显高于组分Ⅰ,达到81.83±0.80%。酶解产物经2步纯化后,其DPPH清除活性得到了显著提高,提高约57.88%。

两种2型糖尿病小鼠溃疡创面愈合比较

目的比较目前常用的基因自发突变2型糖尿病小鼠C57BL/6J-db/db和STZ诱导的C57BL/6J小鼠的溃疡创面愈合特征,为应用稳定的糖尿病小鼠溃疡模型进行相关动物实验研究提供依据。方法建立糖尿病小鼠溃疡模型,统计0、3、5、7、10、14 d小鼠创面动态愈合率及愈合时间;7、14 d取组织,HE染色和Masson染色,免疫组化(CD31和PCNA)观察创面病理组织变化;荧光定量测定愈合相关因子collagen-IIIα、α-SMA的基因表达。结果基因突变db/db小鼠较STZ诱导小鼠的创面愈合时间显著延迟,由(16.6±0.8)d延长至(20.2±1.3)d(P<0.001);db/db组较STZ组肉芽组织生长缓慢,新生上皮长度不足、胶原沉积紊乱,创面愈合较差;7 d,db/db组的CD31和PCNA显著性低表达(P<0.01);7、14 d,db/db组基因上调量的倍数明显低于STZ组。结论两种糖尿病小鼠创面均出现愈合延迟,但基因突变糖尿病db/db小鼠相比于STZ诱导组小鼠在创面愈合延迟的程度上和愈合难易程度上,更适合进行糖尿病溃疡创面的研究。

肝靶向肽-抗肿瘤肽CSP-MDA-7/IL-24融合基因原核表达条件优化

目的:优化肝靶向肽-抗肿瘤肽(CSP-MDA-7/IL-24)在大肠杆菌中诱导表达的相关条件。方法:通过考察CSP-MDA-7/IL-24重组菌生长曲线,选择合适的诱导时机,通过SDS-PAGE检测CSP-MDA-7/IL-24蛋白的表达量,单因素分析诱导时间、培养基p H值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度,在此基础上各选取5个水平进行正交实验,摸索最佳诱导表达条件。结果:培养基p H7.0、IPTG浓度0.12 mmol/L、培养温度42℃、诱导表达4 h为重组蛋白的最佳表达条件。结论:为进一步制备重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24及评价其生物活性奠定了基础。

虎杖苷对2型糖尿病小鼠溃疡创面愈合影响的实验研究

目的研究虎杖苷对2型糖尿病小鼠溃疡创面愈合的作用效果。方法 C57BL/6J雄性小鼠持续喂以高脂饲料4周后,禁食12 h,腹腔注射链脲佐菌素40 mg·kg^(-1)体重,连续注射5 d,1周后,测量随机血糖值高于16.67mmo L·L^(-1)的小鼠为2型糖尿病小鼠。在小鼠背部正中两侧各剪一个0.8 cm的圆形创面深至筋膜,造成小鼠溃疡创面模型。按照血糖值随机将小鼠分为3组:高低2个剂量实验组、对照组,每组15只。造模当天创面局部给药且为实验第1天(实验周期共14 d),实验组分别局部给与400,100μg·m L^(-1)虎杖苷100μL,每天给药一次,连续给药5 d,第6~14天停止给药;对照组给予等量0.9%NaCl。计算实验第3,5,7,10,14天的创面愈合率,统计完全愈合时间,以HE染色观察实验第7,14天时组织形态学变化;以噻唑蓝(MTT)法与划痕实验测定虎杖苷组与磷酸盐缓冲液(PBS)对照组对成纤维细胞增殖趋化效果。以流式细胞仪测定虎杖苷组、白细胞介素-4组、虎杖苷+白细胞介素-4联用组、PBS对照组这4组的原代巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞量。结果实验后第14天,高剂量实验组与对照组的创面愈合率分别是(80.72±5.33)%,(95.93±1.01)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。创面愈合时间:高剂量实验组与对照组分别为(16.6±1.1),(13.2±0.8)d,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。实验后第14天,实验组的胶原纤维排列紧密整齐已愈合,对照组未愈合。实验组的促成纤维细胞增殖最佳浓度为0.5μg·m L^(-1)。实验第1天,实验组与PBS对照组的迁移率分别是(90.20±3.90)%,(76.8±4.87)%,与PBS对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),说明虎杖苷明显具有促成纤维细胞迁移作用。极化为M2型巨噬细胞百分比:实验组与PBS对照组分别是(3.7±0.36)%,(1.97±0.23)%,与PBS对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论虎杖苷具有促进2型糖尿病小鼠溃疡创面愈合的作用。