基于主成分分析的不同产地凉粉草质量评价

[目的]利用主成分分析法对不同产地的凉粉草中总黄酮、总酚酸、总糖、紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸含量进行评价,验证其含量测定方法。[方法]采用HPLC法测定凉粉草中咖啡酸、迷迭香酸、紫云英苷含量;采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮、总酚酸和总糖的含量;对6个成分含量进行主成分分析,评价不同产地质量差异。[结果]建立的含量测定方法稳定、可靠;主成分分析提取3个成分,累计贡献率87.395%,酚酸类和黄酮类物质对于凉粉草的质量评价有重要贡献。通过综合评分,来自广东平远及福建长汀凉粉草质量较好。[结论]20批不同产地的凉粉草质量具有差异性,且产地距离较近的凉粉草表现出成分含量特征相似性;建立的主成分分析方法可对测定指标进行全面分析,适用于凉粉草质量评价。

指纹图谱结合聚类分析、主成分分析的凉粉草质量评价

目的:通过建立凉粉草药材的高效液相(HPLC)指纹图谱,为科学区分及评价不同来源的凉粉草药材提供参考。方法:采用高效液相色谱仪对凉粉草提取溶液进行梯度洗脱,对比不同来源的凉粉草溶液所得色谱图,选取其中9个特征峰,对其峰面积数据采用相似度分析、主成分分析等进行数据处理。结果:建立凉粉草的指纹图谱,20批次的凉粉草相似度较高,基本大于0.9,统计学分析结果基本一致。结论:来自广东平远上举镇、泗水镇、仁居镇等地的凉粉草质量较好;指纹图谱能较好的区分不同产地的凉粉草,为其质量控制提供科学依据。

黑老虎种子质量检验方法研究

目的建立黑老虎种子检验方法,为黑老虎种子质量标准的制定提供依据。方法参照《农作物种子检验规程》实施指南及相关文献,以不同试剂、浸种方式及时间组合处理两批黑老虎种子,通过发芽率筛选最适播种前处理方法;考察不同贮藏方式和时间对发芽率的影响;采用正交试验优化黑老虎种子的红四氮唑(TTC)生活力测定参数;并对黑老虎种子进行水分测定和质量测定。结果黑老虎种子播前处理的最优方法为40℃纯水浸种2 h,室温纯水浸种10 h;发芽试验条件为于自然光照下室温土培,播种后第60天计数。经最优前处理方法处理后的两批次黑老虎种子发芽率分别为60%、88%;此外,种子经密封冷藏6周发芽率可达最高,后快速下降。黑老虎种子生活力的最佳条件为种子穿刺后预湿6 h,用0.3%TTC于40℃避光染色24 h。分别采用低恒温烘干法和百粒法测定两批种子的千粒重分别为210.97、218.18 g,含水量分别为13.15%、18.64%。结论建立了黑老虎种子质量检验方法,黑老虎种子采后密封冷藏有助于一定时间内提高黑老虎种子发芽率。

基于UPLC-Q-TOF-MS的凉粉草不同栽培品系代谢物分析

目的基于代谢组学方法探究凉粉草不同栽培品系(台湾草、平远草和增城草)的差异代谢物,筛选品系鉴别的主要代谢物。方法运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)非靶向代谢组学技术分析不同品系凉粉草的化学成分,数据经主成分分析、正交偏最小二乘判别分析和方差分析处理,筛选不同品系鉴别的代谢物。结果共筛选得到186种差异代谢物,台湾草、平远草与增城草之间的差异代谢物主要显著富集于黄酮类生物合成通路。3个品系均有芸香苷、山奈酚3-O-葡萄糖苷、槲皮素等黄酮类代谢物;结合差异倍数和文献报道,槲皮素、山奈酚3-O-葡萄糖苷可作为3个凉粉草品系区分的差异代谢物。结论UPLC-Q-TOF-MS代谢组学技术可阐明不同品系凉粉草化学成分差异,为其品系鉴别和资源开发提供参考。

基于UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-DAD的不同品种溪黄草主要化学成分分析

采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)鉴定不同品种溪黄草中主要化学成分,通过超高效液相色谱-二极管阵列检测器法(UPLC-DAD)同时测定不同品种溪黄草中5种活性成分(咖啡酸、迷迭香酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、冬凌草甲素)的含量。实验采用Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),以甲醇(B)-0.1%甲酸水(A)为流动相梯度洗脱进行色谱分离,流速0.3 mL·min^(-1),柱温30℃;Q-TOF-MS在电喷雾正离子模式下采集数据,分流比为1∶1;采用UPLC-DAD定量,检测波长245 nm。UPLC-Q-TOF-MS鉴定了不同品种溪黄草中的32种主要化学成分,其中溪黄草(Rabdosia serra)19种,显脉香茶菜9种,线纹香茶菜10种,纤花香茶菜15种,狭基线纹香茶菜10种,长叶香茶菜7种。成功建立了同时测定不同品种溪黄草中5种活性成分的UPLC-DAD方法,各成分的线性关系良好(r>0.9990),精密度、重复性和稳定性良好,回收率在97.01%~102.7%(n=6),RSD均小于3.0%。UPLC-Q-TOF-MS分析结果在一定程度上为长叶香茶菜作为溪黄草药材使用及狭基线纹香茶菜等同纤花香茶菜入药提供了科学依据;建立的UPLC-DAD同时测定不同品种溪黄草中5种活性成分的定量分析方法简便、快捷、准确;该研究也为综合评价不同品种溪黄草的质量提供参考。

青天葵F-box基因的克隆及其与ASK1蛋白互作分析

目的从濒危药用植物青天葵(Nervilia fordii)中克隆F-box基因,为寻找解决青天葵资源紧缺的方法提供依据。方法从青天葵转录组中筛选得到2个F-box基因的核心片段,以RACE技术获得基因的全长并克隆其编码区;通过荧光定量PCR(qRT-PCR)进行组织表达模式分析;利用酵母双杂交实验验证F-box蛋白的F-box区域与拟南芥ASK1蛋白的互作情况。结果从青天葵中克隆到F-box基因NfFBL3和NfFBL4,它们的开放阅读框(open reading frames,ORF)分别长1974、1833 bp,分别编码657、611个氨基酸。二者均包含F-box保守功能结构域,C端具有多个重复亮氨酸序列(Leucine rich repeats,LRRs);NfFBL3和NfFBL4蛋白均为不稳定的疏水蛋白,定位于细胞核,无信号肽及切割位点。系统进化分析表明,NfFBL3和NfFBL4分别与F-box/LRR-repeat protein 3蛋白、F-box/LRR-repeat protein 4蛋白聚在一起。二者均在青天葵的块茎中表达量较高。酵母双杂交实验中NfFBL3的F-box区域能与拟南芥ASK1蛋白互作,而NfFBL4不与ASK1蛋白互作。结论该研究从青天葵中克隆得到2个F-box基因,其中NfFBL3编码的蛋白可与拟南芥ASK1蛋白发生互作,为进一步研究青天葵中Skp1-Cullin-F-box(SCF)复合体的功能提供科学依据。

阳春砂与海南砂BPPS启动子比较及GCN4-motif正调控作用的鉴定

目的龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)是砂仁药效萜类合成途径中的关键酶,获得海南砂AlBPPS的启动子并与阳春砂AvBPPS启动子进行调控元件和瞬时表达的比较,以期解析AvBPPS在种子中高表达的分子机制。方法通过FPNI-PCR的方法从海南砂gDNA中克隆AlBPPS的启动子,并与阳春砂AvBPPS启动子进行序列比较,对启动子相似区域进行截短,获得其相应的截短片段;对AvBPPS启动子截短片段中的GCN4-motif进行突变;构建由上述启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuro-nidase gene,GUS)的重组表达载体,利用农杆菌介导法注射侵染本氏烟草叶片进行瞬时表达,验证启动子的活性和GCN4-motif的功能。结果克隆获得365 bp的AlBPPS启动子序列,3’端约300 bp的序列与AvBPPS启动子的相应序列相似度高达93%,但AlBPPS启动子不含有AvBPPS启动子的GCN4-motif。构建成功与GUS报告基因融合的系列启动子重组载体——VBP∷GUS(AvBPPS启动子全长)、VBPT∷GUS(AvBPPS启动子截短至320 bp)、VBPT-GM∷GUS(截短AvBPPS启动子且突变GCN4-motif)和LBP∷GUS(AlBPPS启动子全长)、LBPT∷GUS(AlBPPS启动子截短至305 bp)。通过GUS染色发现虽然上述启动子均具有驱动GUS基因转录的活性,然而,含有GCN4-motif的启动子,包括全长或截短的AvBPPS启动子(VBP∷GUS和VBPT∷GUS)的活性均高于GCN4-motif突变(VBPT-GM∷GUS)或无GCN4-motif的启动子(LBP∷GUS和LBPT∷GUS)。结论GCN4-motif对基因转录具有正调控作用,为进一步探究AvBPPS启动子的调控机制奠定了基础。