探讨几种中药注射剂对腘窝淋巴结免疫细胞表面分子的影响及其致敏性

目的分析中药注射剂(traditional Chinese medicineinjection,TCMI)对腘窝淋巴结免疫细胞与致敏相关的三类10余种表面分子表达的影响,探讨其用于评价TCMI致敏的可行性。方法选用♀BALB/c小鼠,选取临床上报道有过敏病例发生的痰热清等11种TCMI,后肢足趾部注射免疫动物1次,5 d后处死动物,流式细胞术检测注射侧腘窝淋巴结效应T细胞、B细胞、抗原提呈细胞及早期活化分子CD69+、MHCⅡ、协同刺激分子CD86+、CD40+等3类10余种表面分子的变化。结果痰热清、苦碟子、脉络宁注射液引起三类表面分子明显变化,具有较大的致敏潜能。柴胡、炎琥宁、刺五加等注射液所致的相应变化不明显。结论对免疫细胞三类表面分子变化的综合考察可以初步判断TCMI致敏潜能的强弱,结果与现有不良反应报道具有一致性。

腘窝淋巴结免疫细胞多种表面分子在PLNA评价致敏性中的综合分析

目的利用腘窝淋巴结实验(popliteal lymph node as-say,PLNA)分析腘窝淋巴结免疫细胞多个表面分子在PLNA评价致敏性中的综合变化,旨在提高PLNA的可靠性和灵敏性。方法选用♀BALB/c小鼠,选取具有致敏潜能物质氯化汞(HgCl2)、链脲佐菌素(STZ)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TN-BS)和D-青霉胺(D-pen)为供试品,后肢足趾部注射免疫动物1次,5 d后处死动物,取注射侧腘窝淋巴结制备细胞悬液,流式细胞术检测腘窝淋巴结淋巴细胞、效应T细胞、抗原提呈细胞及其MHCⅡ、协同刺激和早期活化等十余种表面分子的变化,探讨这些表面分子在供试品致敏后的综合改变。结果 HgCl2和TNBS引起腘窝免疫细胞多种表面分子明显变化,D-pen和STZ所致的相应变化不明显。结论腘窝淋巴结免疫细胞表面分子变化的综合分析可以判断供试品的致敏潜能;不同供试品引起表面分子变化的种类和强弱有所不同,在致敏性评价中应综合考察各细胞表面分子的变化。

中药注射剂对免疫细胞表面分子的影响

目的探讨中药注射剂(TCMI)对免疫细胞致敏相关表面分子表达的影响,为TCMI致敏性评价提供参考。方法将雌性BALB/c小鼠用随机区组法分为对照组和12个TCMI组(分别为鸦胆子组、艾迪组、香丹组、葛根素组、红花组、醒脑静组、喜炎平组、舒血宁组、鱼腥草组、生脉组、黄芪组、灯盏细辛组),每组7只小鼠。按照临床等效剂量于12个TCMI组小鼠左后肢足趾部各注射相应TCMI 50μL,对照组注射等体积磷酸盐缓冲液。5 d后处死动物,取左侧腘窝淋巴结制备淋巴细胞悬液,应用流式细胞术检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、CD11c+细胞及F4/80细胞比例,早期活化分子CD69、MHCⅡ和协同刺激因子CD86、CD80、CD40及CD44分子的表达。结果与对照组相比,鸦胆子组CD4+T细胞比例及CD69表达均减低,艾迪组CD8+T细胞比例及CD69表达均减少,但2组B细胞比例均明显增高而其CD69表达均减低;葛根素组、香丹组和喜炎平组B细胞比例均增高而其CD69表达均减低,葛根素组T细胞CD69表达也减低,香丹组和喜炎平组CD8+T细胞比例降低;醒脑静组CD8+T细胞比例及T、B细胞CD69表达均减少;鱼腥草组、灯盏细辛组CD8+T细胞与B细胞CD69表达减低;红花组仅CD8+T细胞比例降低。与对照组比较,鸦胆子组、艾迪组、香丹组CD11c+细胞和F4/80细胞比例均增高,红花组和葛根素组仅F4/80细胞比例升高;除舒血宁组和鱼腥草组外,其他各组CD4+T细胞表面MHCⅡ分子表达均明显增高;鸦胆子组、艾迪组和葛根素组CD11c+细胞CD40表达增高,醒脑静组CD11c+细胞CD80表达升高,香丹组和红花组CD11c+细胞CD86表达增高,F4/80细胞CD40表达减低。与对照组比较,香丹组和喜炎平组CD4+T细胞表面CD44分子表达增高而黄芪组表达减低;鸦胆子组、艾迪组、香丹组、红花组、喜炎平组和醒脑静组CD8+T细胞表面CD44分子表达均增高。结论不同种类TCMI引起的腘窝淋巴结免疫细胞表面分子变化不同,对其综合考察可以为TCMI致敏性评价提供参考和依据。

鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化

【目的】建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法。【方法】以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的MS培养基上,进行愈伤组织诱导和分化再生。以根癌农杆菌EHA105/pCAMB IA1305.2进行转化,将外源GUS(β-葡萄糖醛糖苷酶)基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草,以组织化学染色法检测GUS活性,以聚合酶链反应(PCR)法鉴定基因组中的GUS基因。【结果】MS培养基中添加0.1 mg/Lα-奈乙酸(NAA)、2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)、0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤(KT)适于以鱼腥草叶片为外植体进行离体再生,出芽率达96.7%。潮霉素作为筛选试剂,使用浓度为2.5 mg/L;头孢霉素作为抑菌剂,使用浓度为250 mg/L。经感染的外植体中GUS反应呈阳性的占75.0%,8周统计抗性芽比率5.5%,PCR分析表明GUS基因已整合到鱼腥草基因组中。【结论】通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了较高的离体再生率,实现了鱼腥草的遗传转化。

农杆菌介导鱼腥草遗传转化的主要影响因素

目的:研究鱼腥草遗传转化的影响因素,以提高转化效率,获得转基因植株。方法:通过分析GUS报告基因的瞬时表达和外植体愈伤分化情况比较菌株质粒组合、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间、抗生素种类和浓度等因素对转化的影响,应用PCR和Southern blot技术鉴定转基因植株基因组中的外源基因。结果:菌液浓度A600为0.3、26℃侵染15min条件下侵染,添加乙酰丁香酮有利于转化,适宜的预培养时间和共培养时间与菌株/质粒组合有关,农杆菌LBA4404/pBI121优于EHA105/pCAMBIA1305.2组合。经条件优化,转化外植体的GUS染色阳性率在60%～80%之间,经鉴定外源基因已整合到转基因鱼腥草基因组中。结论:通过影响因素的优化研究,获得了鱼腥草转基因植株,为培育鱼腥草基因工程新品种奠定了基础。

抗菌肽cecropin B和兔NP-1融合基因转化鱼腥草的研究

目的:将抗菌肽cecropin B和兔NP-1(CN)融合基因转入鱼腥草,培育鱼腥草基因工程新品种。方法:设计并合成抗菌肽融合基因CN,构建重组质粒pBI121-CN,并转入农杆菌LBA4404,以农杆菌介导法转化鱼腥草外植体,将卡那霉素筛选获得的再生抗性植株以快速筛选PCR法进一步筛选阳性植株,再提取基因组DNA进行PCR-Southern鉴定,RT-PCR分析目的基因在鱼腥草中的表达,以大肠杆菌K12抑菌圈实验和立枯丝核菌感染实验分析转基因鱼腥草抗菌能力。结果:抗菌肽基因已整合到转基因鱼腥草基因组中并表达,表现出抗菌能力增强的性状。结论:以抗菌肽融合基因CN转化鱼腥草,初步获得抗菌活性提高的转基因植株。