基于细菌16SrRNA基因的PCR扩增与测序分析在临床不常见菌鉴定中的应用

目的探讨细菌16SrRNA基因的广谱PCR扩增与测序分析在临床分离的少见病原菌的鉴定及分类中的价值。方法收集2010年12月至2011年9月来自7家不同医院和机构，常规方法难以鉴定或具有特殊表型的少见菌48株，以及仪器法连续监测报警阳性、但二次传代无细菌生长的液体增菌培养瓶7个，采用细菌16S核糖体核糖核酸（rRNA）基因MicroSeq500试剂盒、通用引物27f-1492r、27f-1525r进行广谱PCR扩增及目的片段的基因测序。运用美国国立生物信息中心“基于局部比对算法的搜索工具（Blast）”，结合“具有法定分类学地位的原核生物名称目录（http：／／W^Ufir．bacterio．cict．fr／）”提供的分类学信息，比较待鉴定细菌与近缘种模式菌株基因序列的相似程度；参考美国临床与实验室标准化协会（CLSI）MM18-A的解释标准，以确定待鉴定细菌的种属及分类学位置。结果采用广谱PCR测定，7份假阳性血培养瓶中，2份扩增到细菌的16SrRNA基因，经序列分析鉴定均为肺炎链球菌。48株不同来源、不同种属的少见菌，均扩增到16SrRNA基因目的片段并成功测序，参考CLSIMM18-A的解释标准，35株（72．9％）直接鉴定到“种”，11株（22．9％）鉴定到“属”，另2株鉴定为可能的新属新种。进一步结合细菌的生化反应特征及其他管家基因序列分析结果，则可鉴定到“种”的细菌可增加到42株（87．5％），其中包括链杆菌、嗜二氧化碳噬纤维菌、玫瑰单胞菌、奴卡菌、弯曲菌、分枝杆菌等具有明确临床意义的少见菌，以及多株近十年内命名的新细菌，如小不动杆菌、富西亚分枝杆菌、黏液玫瑰单胞菌、Halomonasjohnsoniae等。此外，还发现了1个新亚型的胎儿弯曲菌。结论16SrRNA基因测序鉴定能明确提供细菌的遗传学信息，且无种属选择性，对临床少见菌、苛养菌、以及固体培养基不生长的纯培养物等具有独特的优势，是病原微生物鉴定的发展责向.