止咳平喘类中成药中9种非法添加化学成分的定性定量检验方法研究

【目的】建立检测止咳平喘中成药中9种非法添加化学成分的定性定量检验方法。【方法】采用超高效液相色谱—四级杆—飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF)联用技术对止咳平喘类中成药中非法添加的9种化学成分进行定性筛查,经筛查为阳性的样品用高效液相色谱法(HPLC)对止咳平喘中成药中非法添加的9种化学成分进行含量检测。色谱柱采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈及甲酸铵缓冲液(p H 3.65),梯度洗脱,流速为1.0 m L/min,检测波长为225 nm和280 nm。【结果】通过对5批止咳平喘类中成药进行检测,检出1批样品含有磷酸可待因,含量为0.84 mg/m L。【结论】本法简便准确,灵敏度高,适用于止咳平喘类中成药中9种非法添加化学成分的检测。

从中药的不同业态看中药产业的整体发展趋势

本文对几种中药应用形式(传统饮片、配方颗粒、经典名方标准颗粒、中成药、天然药物)的市场表现及相应的技术特点进行简要分析。在一定时期内,几种应用形式在各自发展的情况下相互补充,难以形成一枝独秀的局面。随着饮片代煎服务的进一步完善、经典名方标准颗粒的上市,可能会解决目前中药配方颗粒和中成药面临的问题,进一步提升中药的市场竞争力。而疗效确切的天然药物、中药小复方有望成为中药行业新的增长点。

顶空-气相质谱联用技术分析凉粉草挥发性成分

【目的】分析不同加工方式和不同栽培品种凉粉草挥发性成分差异。【方法】采用顶空-气相色谱质谱联用(HS-GC-MS)技术测定分析不同凉粉草样品挥发性成分,分析结果通过质谱标准库检索,并采用面积归一化法计算相对质量分数,比较不同样品挥发性成分差异。【结果】从台湾凉粉草和本地凉粉草中共鉴别出24种挥发性成分,主要为烯类成分。2种凉粉草中均含有较大比例的石竹烯,台湾凉粉草中含12.9%,本地凉粉草中含34.2%。台湾凉粉草中特有成分α-芹子烯、β-芹子烯和α-红没药醇等共占25.5%。微发汗处理对凉粉草中石竹烯类成分的影响较大。【结论】建立的HS-GC-MS联用技术可对凉粉草的挥发性成分进行快速、有效的定性分析,且本地凉粉草与台湾引种的凉粉草挥发油特征成分差异较大,可为其鉴别提供参考。

黄芪破壁饮片的DNA条形码鉴别与黄酮类成分HPLC指纹图谱研究

目的:利用DNA条形码技术对黄芪破壁饮片进行物种鉴定,再建立其黄酮类成分HPLC指纹图谱,为其质量控制和鉴定提供依据。方法:提取15批样品的DNA进行序列分析和物种鉴定。物种鉴定后采用高效液相色谱法,色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-0.15%甲酸溶液梯度洗脱;流速0.6 m L/min;检测波长254 nm;柱温25℃;结果:经DNA条形码鉴定,实验所用的15批样品均被鉴定为蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。在此基础上建立了15批样品的HPLC指纹图谱,标定11个共有峰,15批样品的相似度在0.9-1.0之间。结论:DNA条形码和指纹图谱两种方法可对黄芪破壁饮片进行物种鉴定和全面反映黄芪破壁饮片中的成分信息,可用于黄芪破壁饮片的真伪鉴定和批间一致性评价。

不同粒径黄芪超微粉理化性质的研究

目的:对不同粒径黄芪超微粉理化性质进行研究,为黄芪超微粉生产以及粒径的控制提供实验依据。方法:采用气流粉碎机制备黄芪不同粒径的超微粉体,对其粒径、形貌结构、流动性、吸湿性、有效成分溶出度等进行考察。结果:随着粒径的减小,黄芪粉体的比表面积增加,流动性稍有降低,吸湿性稍有增加,收率降低,有效成分溶出速率、溶出量以及相对累积溶出百分率总体来说有所增加。结论:适度的微粉化能促进黄芪有效成分的溶出,然而粒径太小,收率过低不符合生产实际,实际生产过程中应综合考察优选最佳粉碎粒径。

毛冬青三萜C-28位氧化酶基因的克隆与功能研究

目的对毛冬青三萜C-28位氧化酶基因进行挖掘与功能鉴定。方法在前期获得的毛冬青转录组数据中,筛选出1个可能参与毛冬青三萜C-28位氧化的CYP基因(IpAO1),将IpAO1与毛冬青三萜合酶IpAS1共转化酿酒酵母,验证IpAO1的功能。结果 Western Blot结果表明,重组酵母能够表达与预期大小相符的IpAS1蛋白和IpAO1蛋白。GC-MS分析结果显示,仅表达IpAS1基因的重组酵母产生了α-香树脂醇和β-香树脂醇,而共表达IpAS1和IpAO1基因的重组酵母合成了熊果酸和齐墩果酸。结论来源于毛冬青的IpAO1是编码一个α-香树脂醇/β-香树脂醇的C-28位氧化酶。

HS-GC-MS结合ROAV分析不同品种橘红花挥发性成分

目的:系统研究不同品种橘红花挥发性成分差异和香气特征。方法:利用顶空-气相色谱-质谱法(HSGC-MS)对4个品种(“光青”“假西洋”“密叶正毛”和“黄龙正毛”)共40批橘红花的挥发性成分进行检测,结合相对气味活度值(ROAV)分析其中的关键香气成分。采用多元统计分析筛选不同品种橘红花显著性差异成分和特征香气成分。结果:HS-GC-MS检测结果显示,从4个品种橘红花中共鉴定出40个挥发性成分,主要包括烯烃类、醇类、酯类、酮类和醛类,其中以柠檬烯、β-月桂烯、芳樟醇、反式-橙花叔醇等为共有且含量较高的成分。通过ROAV确定了4个品种橘红花共有关键香气成分8个。挥发性成分差异分析结果显示,21个差异标志物可用于品种判别,其中β-蒎烯是“假西洋”的特征香气成分,芳樟醇是“密叶正毛”的特征香气成分,苯乙醛、反式-橙花叔醇和邻氨基苯甲酸甲酯是“黄龙正毛”的特征香气成分。结论:HS-GC-MS结合ROAV系统分析可区分不同品种橘红花并鉴定差异性的特征香气成分,该方法可为橘红花的品种判别和资源综合开发利用提供参考。

黄芪破壁饮片煎煮、冲泡与传统饮片煎煮后5种有效成分溶出含量比较

目的:比较黄芪破壁饮片煎煮、冲泡与传统饮片煎煮后有效成分溶出含量的差异,为黄芪破壁饮片临床应用提供参考。方法:通过正交试验确定黄芪破壁饮片和传统饮片最优的煎煮工艺[液料比(m L/g)、煎煮次数、煎煮前浸泡时间(min)]以及破壁饮片最优冲泡工艺[水温(℃)、液料比、冲泡次数],在各自的最优工艺下比较5种成分(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素)在不同煎煮/冲泡时间点的溶出含量差异。结果:黄芪破壁饮片按最优煎煮工艺(液料比50∶1,煎煮前不浸泡,煎煮2次)煎煮5~10 min时其有效成分溶出含量已达到传统饮片煎煮(煎煮前浸泡30 min,液料比50∶1,煎煮3次)30 min的溶出含量;其在最优冲泡工艺(液料比75∶1,水温100℃,冲泡3次)下有效成分可以达到传统饮片煎煮时溶出含量的80%~90%。结论:黄芪饮片经过破壁后有效成分溶出速率更快,可以免去煎煮前浸泡时间,并减少煎煮时间、次数,煎煮效率显著提高;临床使用时可采用冲泡方式。

仙草总黄酮提取纯化工艺优化及其抗氧化活性

目的优化仙草总黄酮提取纯化工艺,并评价其抗氧化活性。方法在单因素试验基础上,以乙醇体积分数、料液比、提取时间为影响因素,总黄酮提取量为评价指标,正交试验优化提取工艺;以总黄酮吸附率、解吸附率为指标,考察不同型号大孔树脂对纯化效果的影响。然后,通过测定总黄酮DPPH清除能力考察纯化产物抗氧化活性。结果最佳提取条件为乙醇体积分数50%,料液比1∶50,提取时间1.5 h,总黄酮提取量1 335 mg。X-5型大孔树脂最适合纯化总黄酮,吸附量为12.73 mg/g,解吸率为58.84%,最佳纯化条件为0.3 mg/m L、p H 2~4的粗提物静态吸附24 h,以2 BV/h速率用10%、20%、30%、40%乙醇进行梯度洗脱。纯化后总黄酮对DPPH自由基的清除能力增强,IC50为21μg/m L。结论该工艺稳定可靠,仙草总黄酮纯化后抗氧化活性显著提高。

鸡血藤醇提物对高脂血症大鼠血脂及抗脂质过氧化作用的影响

【目的】观察鸡血藤醇提物对高脂血症大鼠血脂及抗脂质过氧化作用的影响。【方法】将36只SPF级SD雄性大鼠,随机分为6组:正常组,模型组,辛伐他汀组(剂量为8 mg·kg-1·d-1),鸡血藤低、中、高剂量组(剂量分别为2、4、8 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组6只,采用喂饲高脂饲料复制高血脂症大鼠模型,预防性给药12周后采血取肝脏,测定各组大鼠血脂水平、肝脏酶活力及肝组织病理变化。【结果】与模型组比较,鸡血藤醇提物可显著降低大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平和肝脏TG含量,显著提高大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平、肝组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力(P<0.05或P<0.01)。鸡血藤醇提物中、高剂量组大鼠的肝细胞脂肪变性程度均较模型组有明显改善。【结论】鸡血藤醇提物有较好的降低血脂和抗氧化保肝作用。

广藿香FPPS重组蛋白表达及互作蛋白筛选分析

对广藿香的法尼基焦磷酸酶(PatFPPS)进行重组蛋白的原核表达,并筛选与之互相作用的蛋白。利用PCR扩增PatFPPS编码区并连接到pGEX-6P-1表达载体,测序验证后将质粒转化BL21(DE3)表达菌株,并用IPTG诱导表达蛋白,最终得到带有GST标签的PatFPPS融合蛋白。利用GST Pull-Down技术,将GST-PatFPPS融合蛋白分别与广藿香叶片总蛋白进行体外孵育,洗脱得到蛋白复合物,经SDS-PAGE及LC-MS/MS鉴定。结果表明,PatFPPS原核表达体系成功建立,获得纯化重组蛋白,并且筛选得到一些候选PatFPPS互作蛋白。利用优化的原核表达体系,可获得可溶性的PatFPPS蛋白,并鉴定得到与之互作的候选蛋白。

黄芪破壁粉的粉体学性质

为尝试现代高分子材料科学的研究方法和技术,初步明确黄芪破壁粉粉体特性的表征指标及分析方法,以黄芪破壁粉为例,研究黄芪破壁粉粉体特性的表征指标及分析方法。制备10批次黄芪破壁粉,考察其粒径分布、堆密度、比表面积、休止角、色度的影响因素,确定黄芪破壁粉粉体指标测定的方法,建立黄芪破壁粉的粉体学指标。结果表明:建立的测定黄芪破壁粉粒径、比表面积、堆密度、流动性、色度的方法可以用于粉体测定,且最佳粒径分布在16.417~44.113μm之间,堆密度为0.17~0.28g/mL,比表面积为1.6448~2.5098m2/g,休止角平均值为48.87°,色度为87.22~89.57。

响应面法优化三叉苦黄酮提取工艺及抗氧化活性分析

目的采用星点设计-响应面法优化三叉苦总黄酮提取工艺,并考察抗氧化活性。方法在单因素考察结果的基础上,对三叉苦总黄酮提取工艺中乙醇体积分数(%)、液料比(ml/g)、加热回流提取时间(min)3个因素进行优化,得到较优的总黄酮提取工艺。通过测定三叉苦总黄酮DPPH和ABTS自由基清除能力评价其抗氧化活性。结果三叉苦总黄酮最佳提取工艺:乙醇体积分数90%,液料比10 ml/g,提取时间30 min,该条件下实际的提取率2.99%,与预测值3.25%偏差较小,清除DPPH和ABTS自由基能力较强。结论运用响应面设计得到的方法稳定可靠,可用于三叉苦总黄酮的提取。三叉苦有显著的抗氧化能力,为其进一步开发和应用提供一定依据,在功能食品和药品开发方面具有较好前景。

顶空-气质联用法比较不同品种橘红胎挥发性成分差异

目的 建立快速分析橘红胎中挥发性成分的方法,比较不同品种橘红胎挥发性成分的差异。方法 采用静态顶空-气质联用(HS-GC-MS)技术分析橘红胎样品。采用质谱标准库(NIST17、WILEY275)检索,确定不同品种橘红胎中挥发性成分并比较差异,通过主成分分析、聚类分析对不同品种橘红胎进行归类。结果 共鉴定出橘红胎中49个挥发性成分,包括有烯类、醛类、醇类等,其中以烯类成分含量最高,超过总挥发性成分50%。副毛橘红胎中含有较高的乙酸龙脑酯,此成分在以柚类作为砧木的密叶红肉正毛、密叶黄龙正毛橘红胎中亦有检出,但含量较低。主成分分析和聚类分析均可将橘红胎按品种区分,两者的结果相一致。结论 不同品种的橘红胎挥发性成分有较大差异。所建立的HS-GC-MS分析方法稳定可靠,可用于橘红胎中挥发性成分的测定。

橘红胎商品规格等级评价

目的对橘红胎的性状特征及黄酮类成分进行测定,为制定橘红胎商品规格等级划分提供参考。方法收集54批样品,观察其果实形状特征,测定总黄酮、柚皮苷、野漆树苷、柚皮素含量。通过相关性分析、主成分分析、聚类分析探究橘红胎状特征与其黄酮类成分的相关性。结果K-均值聚类分析可将橘红胎分为一等、二等、三等,其中一等品果实直径<20.00 mm,质量<5.00 g,总黄酮、柚皮苷、柚皮素、野漆树苷含量分别大于38.00%、35.00%、1.12%、0.09%;二等品果实直径20.00~50.00 mm,质量5~25 g,4种成分含量分别为38.00%~30.00%、35.00%~25.00%、1.12%~0.99%、0.09%~0.08%;三等品果实直径>50.00 mm,果实质量>25.00 g,4种成分含量分别为30.00%~10.00%、25.00%~7.49%、0.99%~0.47%、0.08%~0.04%。结论本实验将橘红胎形状特征与黄酮类成分含量相结合,可为该药材商品等级评价提供参考。

基于主成分分析的不同产地凉粉草质量评价

[目的]利用主成分分析法对不同产地的凉粉草中总黄酮、总酚酸、总糖、紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸含量进行评价,验证其含量测定方法。[方法]采用HPLC法测定凉粉草中咖啡酸、迷迭香酸、紫云英苷含量;采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮、总酚酸和总糖的含量;对6个成分含量进行主成分分析,评价不同产地质量差异。[结果]建立的含量测定方法稳定、可靠;主成分分析提取3个成分,累计贡献率87.395%,酚酸类和黄酮类物质对于凉粉草的质量评价有重要贡献。通过综合评分,来自广东平远及福建长汀凉粉草质量较好。[结论]20批不同产地的凉粉草质量具有差异性,且产地距离较近的凉粉草表现出成分含量特征相似性;建立的主成分分析方法可对测定指标进行全面分析,适用于凉粉草质量评价。

毛冬青三萜C-28位氧化修饰相关CYP450基因的发掘和功能鉴定

药用植物毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.含有大量的五环三萜及三萜皂苷,化学结构复杂多样。三萜类化合物骨架的修饰与其生物合成途径下游的一类关键酶——细胞色素P450单加氧酶(CYP450)密切相关。本研究通过分析毛冬青转录组数据,筛选到1个可能具有五环三萜C-28位氧化功能的CYP450基因(IpAO2)。克隆IpAO2基因并将其通过质粒转化法导入能高效合成amyrin的酿酒酵母工程菌中,GC-MS分析重组酵母代谢产物,发现IpAO2基因编码的蛋白可以将α-amyrin和β-amyrin分别氧化为熊果酸和齐墩果酸,确定IpAO2是一个五环三萜C-28位氧化酶基因。IpAO2基因的鉴定对全面阐明毛冬青三萜及三萜皂苷的生物合成机制具有重要意义,为后期开展毛冬青活性三萜类化合物的代谢工程研究奠定了基础。

阳春砂单萜合酶基因AvTPS1载体构建和原核表达

目的构建AvTPS1的原核表达载体并进行蛋白表达,为该基因在原核表达系统中的功能鉴定奠定基础。方法用In-Fusion方法构建AvTPS1截掉转运肽的表达载体;用Gateway方法构建AvTPS1包含完整阅读框的表达载体;两种表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和BL21DE3plys中进行诱导表达,用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)以及Western杂交检测蛋白的表达情况。结果构建了原核表达载体pET-32a(+)-(-tp)AvTPS1和pDEST17-AvTPS1;这两个表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21DE3plys中均没有表达出明显的相应蛋白,但是这两个载体在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达后,用Western杂交检测有蛋白存在。结论成功构建了阳春砂单萜合酶基因AvTPS1的表达载体和工程菌。

植物磺基转移酶研究进展

磺基转移酶(SOT)能催化磺酸基团(SO3-)从通用供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸转移到外源化合物、激素、蛋白质等底物的羟基或氨基上,这一过程被称为磺化。SOT具有高度保守的结构域,广泛存在于真细菌和真核生物中,参与生物体的多种代谢活动,如解毒、激素调节和药物代谢等。在植物中,磺化反应在调节生长发育和适应逆境等方面起着重要作用。本文结合国内外关于SOT的报道,综述了植物SOT的来源、底物特异性、结构和生物学功能,并对植物SOT的功能挖掘及应用前景进行了展望。

阳春砂与海南砂BPPS启动子比较及GCN4-motif正调控作用的鉴定

目的龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)是砂仁药效萜类合成途径中的关键酶,获得海南砂AlBPPS的启动子并与阳春砂AvBPPS启动子进行调控元件和瞬时表达的比较,以期解析AvBPPS在种子中高表达的分子机制。方法通过FPNI-PCR的方法从海南砂gDNA中克隆AlBPPS的启动子,并与阳春砂AvBPPS启动子进行序列比较,对启动子相似区域进行截短,获得其相应的截短片段;对AvBPPS启动子截短片段中的GCN4-motif进行突变;构建由上述启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuro-nidase gene,GUS)的重组表达载体,利用农杆菌介导法注射侵染本氏烟草叶片进行瞬时表达,验证启动子的活性和GCN4-motif的功能。结果克隆获得365 bp的AlBPPS启动子序列,3’端约300 bp的序列与AvBPPS启动子的相应序列相似度高达93%,但AlBPPS启动子不含有AvBPPS启动子的GCN4-motif。构建成功与GUS报告基因融合的系列启动子重组载体——VBP∷GUS(AvBPPS启动子全长)、VBPT∷GUS(AvBPPS启动子截短至320 bp)、VBPT-GM∷GUS(截短AvBPPS启动子且突变GCN4-motif)和LBP∷GUS(AlBPPS启动子全长)、LBPT∷GUS(AlBPPS启动子截短至305 bp)。通过GUS染色发现虽然上述启动子均具有驱动GUS基因转录的活性,然而,含有GCN4-motif的启动子,包括全长或截短的AvBPPS启动子(VBP∷GUS和VBPT∷GUS)的活性均高于GCN4-motif突变(VBPT-GM∷GUS)或无GCN4-motif的启动子(LBP∷GUS和LBPT∷GUS)。结论GCN4-motif对基因转录具有正调控作用,为进一步探究AvBPPS启动子的调控机制奠定了基础。