肿瘤炎症微环境的中医属性及治则研究

肿瘤炎症微环境由炎症细胞、肿瘤细胞以及各种基质细胞伴随大量细胞因子、趋化因子浸润等共同构成,对肿瘤细胞增殖、侵袭、血管生成及放化疗抵抗起到作用。具有邪热内蕴、痰饮停滞、瘀血阻滞、正气亏虚等病机特征,是微观层面的中医证候表现。基于炎症微环境异常,中医辨证论治提出清热解毒、化痰散结、活血化瘀、扶正固本的肿瘤治则治法,在缓解患者临床症状、调节机体免疫方面有良好的治疗前景。

基于中医理论探讨自噬在肿瘤转移中的作用机制

肿瘤转移是导致患者临床治疗失败继而死亡的主要原因,在恶性肿瘤转移中,正气亏虚是其内在根本原因,癌毒流注是必要条件,痰凝血瘀是其主要促使因素,因此恶性肿瘤转移当以扶正祛邪为主,并辅以活血化瘀、化痰散结,修复受损之络脉。自噬对肿瘤转移的双向调节作用与机体正气不足,邪气入侵,癌毒内生,痰瘀互结所致的病机有异曲同工之处。"正虚邪实"是从中医的角度阐述肿瘤转移的病因病机。自噬在肿瘤转移中起着双向调控作用,自噬不足或者自噬过度,都可能导致内环境稳态的破坏而促进肿瘤转移。调节细胞自噬水平是防治肿瘤转移的重要途径,从中医学的角度来认识自噬的变化过程有助于拓展中医药对自噬的研究。

基于肿瘤干细胞探讨中医癌毒病机学说

癌毒是肿瘤进程中的关键病机,而肿瘤干细胞是肿瘤生长、转移及复发的主要原因。通过比较癌毒与肿瘤干细胞的概念、致病特征与致病机制,发现二者有诸多相似之处。癌毒病机理论符合现代医学对肿瘤干细胞的认识,肿瘤干细胞可能是癌毒病机的重要生物学内容。从中西医角度探讨癌毒与肿瘤干细胞的科学内涵,对进一步揭示肿瘤的致病机制及提高恶性肿瘤的临床治疗效果具有重要的意义。

白花鬼针草中多烯炔类成分的分离及其生物活性研究

为了解白花鬼针草(Bidens pilosa var.radiata)的化学成分,采用多种色谱技术从其提取物中分离多烯炔类成分,并对其生物活性进行研究。结果表明,从白花鬼针草乙酸乙酯提取部位中分离鉴定出4个多烯炔类化合物,分别为5-acetoxy-2-phenylethinyl-thiophene(1)、1-phenylhepta-1,3,5-triyne(2)、5-phenyl-2-(1-propynyl)-thiophene(3)和icthyothereol acetate(4)。体外活性评价结果表明,化合物1~4均具有中等抗MRSA活性,且均对人肝LO2细胞无毒性。首次为化合物1提供核磁数据并进行结构解析,化合物3、4为首次从该属植物中分离得到。

柯里拉京抑制LPS和ATP激活的NLRP3炎症小体和巨噬细胞焦亡

目的探讨柯里拉京对细菌脂多糖(LPS)联合腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)诱导的巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡的调控作用和机制。方法采用CCK8试剂检测不同浓度柯里拉京对J774A.1细胞活力的影响;碘化丙啶(PI)染色和乳酸脱氢酶(LDH)释放检测柯里拉京对LPS+ATP诱导的细胞死亡的影响。Western blot法检测细胞上清液中炎症小体活化标志物caspase-1 p20(Mr20000)和成熟IL-1β(Mr17000)的表达水平,以及检测细胞内NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β前体(pro-IL-1β)和焦亡执行蛋白GSDMD的表达。ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β的水平。活性氧(ROS)荧光探针H2DCFDA染色观察柯里拉京对ROS产生的影响。结果柯里拉京浓度小于40μmol·L-1时对细胞活性影响较小。柯里拉京减少LPS+ATP刺激的细胞内PI阳性细胞的比例和LDH的释放。柯里拉京抑制LPS+ATP刺激的巨噬细胞内GSDMD蛋白N末端(GSDMD-NT)的表达,以及减少细胞释放caspase-1 p20和成熟IL-1β到培养上清。柯里拉京抑制细胞分泌炎症因子IL-1β和减少ROS的产生。然而ROS的诱导剂鱼藤酮能拮抗柯里拉京抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡的作用。结论柯里拉京抑制LPS+ATP诱导的巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡依赖于抗氧化作用。

转录组数据分析肺腺癌和肺鳞状细胞癌中基因的差异表达

目的对非小细胞肺癌两种亚型肺腺癌和肺鳞状细胞癌的基因差异表达进行生物信息学分析,寻找非小细胞肺癌潜在的生物学标志物运用于临床诊断,进而提高患者生存率。方法获取肺腺癌和肺鳞状细胞癌的基因表达谱分析数据集,使用R语言处理,t检验分析鉴定肺腺癌和肺鳞状细胞癌之间的转录组差异,并通过维恩图显示所鉴定的基因差异表达。从GEO获得差异表达的基因,用DAVID及IPA进行分析,进一步确定潜在可用于鉴别肺腺癌和肺鳞状细胞癌的几种信号通路和生物标记。利用TCGA数据和临床肺癌样本中的生物标记表达,验证Osteoarthritis pathway和LXR/RXR分别在肺腺癌和肺鳞状细胞癌的基因差异表达;挑选miR-181b-5p及其靶基因WNT5A和MBD2进行验证,收集23例肺鳞癌患者的肺肿瘤组织(23例肿瘤组织,实验组)及其邻近肺组织(23例癌旁肺组织,对照组),检测miR-181b-5p和其靶基因WNT5A和MBD2的表达差异用于鉴别肺腺癌和肺鳞状细胞癌。结果GEO数据分析结果揭示肺腺癌和肺鳞状细胞癌的差异表达基因:肺腺癌中有851个DEGs(276个上调,575个下调),而肺鳞状细胞癌中有885个DEGs(406个上调,479个下调)。DAVID和IPA分析差异表达基因结果显示,白细胞迁移和炎症反应在肺腺癌中比肺鳞状细胞癌富集程度更高,Osteoarthritis pathway在肺腺癌中是抑制状态,而在肺鳞状细胞癌中显示是激活状态。IPA对重要转录因子、细胞因子和miRNA的分析结果显示肺腺癌和肺鳞状细胞癌之间的区别主要是:转录因子(GATA4,RELA,YBX1,TP63和MBD2);细胞因子(WNT5A和IL-1A)和microRNA(miR-34a,miR-181b和miR-15a)。其中miR-34a和IL-1A、miR-15a和YBX1、miR-181b和WNT5A和MBD2可作为鉴别非小细胞肺癌亚型的成对microRNA和mRNA靶点。临床样本实验结果支持miR-181b-5p的表达上升和WNT5A的表达下调可视为诊断肺鳞状细胞癌的分子标记物。结论通过对转录组数据分析,发现了肺腺癌和肺鳞状细胞癌的候选基因、成对的microRNA鉴别肺腺癌和肺鳞状细胞癌,为其鉴别诊断和治疗提供了新的思路。

乳腺癌干细胞相关miRNA的高通量筛选及miR-25介导自噬对乳腺癌干细胞的调控作用

目的探讨乳腺癌干细胞相关微RNA(miRNA)的高通量筛选及miR-25介导自噬对乳腺癌干细胞的调控作用。方法以MDA-MB-231乳腺癌干细胞为研究对象,通过干细胞成球实验、高通量芯片检测、生物信息学分析、乙醛脱氢酶(ALDH)流式检测、实时自噬活性监测及自噬相关蛋白表达的检测明确miRNA如何通过介导自噬影响乳腺干细胞自我更新能力。结果miRNA微阵列芯片共筛选出131个差异miRNA,其中56个上调miRNA,57个下调miRNA。与非乳腺癌干细胞相比,一部分miRNA在乳腺癌干细胞上低表达,其中miR-25的表达在乳腺癌干细胞内显著下调约41%。差异的miRNA按照5个数据库(miRWalk、miRanda、miRDB、RNA22和Targetscan)来预测其靶基因,共获得4565个靶基因。与紫杉醇单药组相比,紫杉醇联用3-甲基腺嘌呤或氯喹均导致成球直径缩小近1/2[(254±16)μm、(226±38)μm比(494±44)μm](均P<0.05)。与空白对照组相比,紫杉醇组的微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ表达水平升高且p62表达水平降低;与Nc+紫杉醇组相比,Mimics+紫杉醇组的UNC-51样激酶1蛋白表达明显降低。结论miR-25可能是介导自噬活性与乳腺癌干细胞之间的重要信号分子,其表达异常可能与其启动子区域DNA甲基化调控有关。

小窝蛋白-1在肿瘤发生发展中的作用

小窝蛋白-1(Cav-1)是一种支架蛋白,对恶性肿瘤的发生、发展起关键调控作用。在恶性肿瘤起始阶段,Cav-1可促进肿瘤血管新生并介导肿瘤干细胞无限增殖及自我更新;在恶性肿瘤转移阶段,Cav-1可参与肿瘤细胞的黏附运动、失巢凋亡和自噬形成;此外,Cav-1的表达可直接或间接促进肿瘤多药耐药,同时也能影响肿瘤细胞与间质微环境的相互作用。然而,不同肿瘤或同一肿瘤不同阶段的Cav-1表达具有显著差异性和两面性,因此Cav-1作为抑癌因子或致癌因子一直存在争议。深入研究Cav-1信号转导通路及其与肿瘤的关系,有望为诊断、治疗、预防相关肿瘤提供新途径。

重组蛋白PFKFB3的表达、纯化及酶活测定

目的 研究大肠杆菌中人6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶亚型3(PFKFB3)重组蛋白的诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及酶活测定。方法 通过在感受态细胞BL21(DE3)中转入PFKFB3原核质粒,经终浓度为25μg/ml的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在16℃培养细菌过夜,表达PFKFB3重组蛋白。冰上超声破菌,离心收集蛋白,通过镍(Ni)柱亲和层析和分子筛纯化蛋白,运用焦磷酸-磷酸果糖激酶(PPi-PFK)法测定PFKFB3酶活性。结果 蛋白丰度图谱结果显示,PFKFB3蛋白经过Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,基本只有1个PFKFB3的强吸收峰,纯化效果良好。应用考马斯亮蓝法测定PFKFB3蛋白浓度为2~4μg/μl,成功获得了较高纯度和浓度的PFKFB3重组蛋白。通过PPi-PFK酶活性分析法测得PFKFB3的果糖-6-磷酸(F-6-P)和三磷酸腺苷(ATP)位点的米氏常数(Km)值分别为142.5、34.21μmol/L。结论 人PFKFB3表达载体的成功构建以及重组蛋白纯化,为进一步进行其功能研究和抑制剂研发奠定了基础。

基于表观遗传定义的肿瘤外泌体及其中医证本质

肿瘤外泌体具有信号传导、靶向特异性等生物学特性,是机体通过表观遗传修饰而呈现异质性的重要载体,也是肿瘤治疗的重要靶点。肿瘤外泌体的表观遗传调控作用可通过调节基因的表达影响肿瘤及其微环境。与中医学中的后天养成作用相类似,两者均可造成个体体质差异,并都具有可塑性。这种后天调控导致的基因表达差异可视为中医证候变化的本质,因而肿瘤外泌体可成为中医肿瘤辨证论治的可操作目标及重要载体。因此,以肿瘤外泌体为突破口,有望解码表观遗传驱动下中医证候的现代化含义。

黄芩苷通过抑制ROS介导的PI3K/Akt/FoxO3a信号通路诱导HepG2细胞铁死亡

运用网络药理学和体外实验探究黄芩苷是否诱导HepG2细胞发生铁死亡并探讨潜在机制。体外培养HepG2细胞,CCK-8法检测细胞活力。TCGA数据库获取肝癌转录组测序数据,FerrDb V2数据库获取铁死亡基因数据。使用DEG2程辑包筛选差异表达基因,并与铁死亡基因取交集,得到介导铁死亡调节肝癌进程的靶向基因。通过基因本体数据库(Gene Ontology,GO)与京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)以P<0.05、|log2(fold change)|>0.5为标准,分析模块相关的分子功能及结构。DCFH-DA探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化。试剂盒检测细胞还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、Fe^(2+)水平。实时荧光定量聚合酶链式反应(realtime quantitative PCR,RT-PCR)检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)mRNA表达。蛋白质印迹法检测GPX4、SLC7A11、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表达。CCK-8检测结果显示,200μmol·L-1黄芩苷干预48 h,能显著抑制HepG2细胞活力。网络药理学结果显示,可通过PI3K/Akt信号通路调节肝癌中铁死亡的发生。细胞实验结果显示,黄芩苷可下调SLC7A11,降低GSH水平和GPX4表达,诱导HepG2细胞ROS累积,增加Fe^(2+)产生。铁死亡抑制剂(ferrostatin-1,Fer-1)可减少黄芩苷诱导的ROS累积,上调SLC7A11、GSH和GPX4表达,减弱PI3K、Akt、FoxO3a磷酸化。综上,黄芩苷可通过抑制ROS介导的PI3K/Akt/FoxO3a通路诱导HepG2细胞铁死亡。

冠心病痰证患者TGF-β1-PI3K-GAG通路研究

目的:以糖胺聚糖(GAG)为切入点探求冠心病患者痰证相对于阴虚证所存在的差异及其可能机制。方法:收集广东省中医院心血管一科冠心病患者52例,分别提取冠心病痰证及阴虚证患者血清GAG,及患者血清作用小鼠血管平滑肌细胞后的GAG。硫酸咔唑法进行GAG含量测定,凝集素检测法测定GAG种类,Western Blot法测定多能蛋白聚糖Versican,ELISA法测定患者血清中的转化生长因子-β1(TGF-β1)含量和多功能蛋白聚糖Versican含量;TGF-β1依赖Smad通路抑制剂SB525334和PI3K通路抑制剂MK2206干预后,再测定GAG含量,观察痰证与阴虚证GAG检测值差异对应的信号通路。结果:冠心病患者痰证相比于阴虚证,血清中GAG差异无统计学意义。相近血糖水平的痰证患者血清作用于平滑肌细胞后,较阴虚证患者作用后,GAG增高(P<0.05),进一步分析发现增高的GAG主要是硫酸软骨素/硫酸皮肤素(CS/DS),硫酸软骨素类蛋白聚糖(CSPG)中Versican表达升高(P<0.05);与阴虚证比较,痰证患者血清中Versican含量差异无统计学意义,TGF-β1含量增高(P<0.01);添加TGF-β1后,平滑肌细胞GAG含量升高;与阴虚证血清相比,添加痰证血清明显升高平滑肌细胞的GAG含量;在抑制Smad通路后,痰证组GAG比阴虚证组GAG增高的效应仍存在,而在抑制PI3K通路后,痰证组GAG比阴虚证组GAG增高的效应消除了。结论:冠心病痰证患者TGF-β1-PI3K-GAG通路,可能是痰病变的特征信息,其中TGF-β1与生痰因子相关,而GAG和Versican作为痰的可能物质基础,因其主要在组织间隙,在血清中反应不够灵敏。

基于癌毒病机理论探讨外泌体对肿瘤及肿瘤微环境的交互作用

肿瘤外泌体为肿瘤微环境重要组成部分,可导致肿瘤侵袭转移,中医癌毒病机理论认为癌毒是肿瘤发生发展过程中产生的一种特异性致病因子。通过比较肿瘤外泌体和癌毒的概念、病理特性以及致病机制,发现二者有诸多共性。作用于肿瘤自身时,肿瘤外泌体可抑制免疫应答、增加肿瘤的侵袭转移能力、促使肿瘤耐药,一方面,与癌毒所呈现的耗损正气、走注流窜以及凶顽缠绵的致病特性相似。另一方面,作用于肿瘤微环境时,肿瘤外泌体在免疫微环境、炎性微环境、缺氧微环境以及酸性微环境等调控机制中发挥重要作用,同时癌毒可致正气亏虚,并常与瘀、热、痰湿胶结,两者所致病理状态具有一致性。综上,肿瘤外泌体是癌毒病机的重要生物学内容,癌毒病机理论符合现代医学对肿瘤外泌体的认识。通过深入探究癌毒与肿瘤外泌体对肿瘤及肿瘤微环境的交互作用,有助于理解两者的科学内涵,丰富中医癌毒病机理论,对进一步揭示肿瘤的致病机制以及提高癌症的临床治疗效果具有重要意义。