六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法制备六味地黄丸含药血清(分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清)及10.0%对照血清。采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白(Cx)26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26-309、Cx26-337、Cx26-367、Cx26-2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26-2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)抑制剂甘草次酸(GA)对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组(简称低、中、高剂量组)及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20mol/L,GA终浓度为50mol/L。结果六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)与阻断后细胞抑制率(29.14%、38.71%、58.13%)比较,显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。

人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因治疗的增效作用

【目的】观察人参总皂苷联合自杀基因HSV-tk/GCV治疗系统对小鼠黑色素瘤的生长抑制效应,探讨人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因治疗的增效作用。【方法】选用85只C57BL/6J雄性小鼠,除正常组5只外其他均接种含20%B16tk+细胞的tk+和tk-混合细胞,造模成功后随机分为模型组、人参总皂苷组、tk/GCV组、人参总皂苷联合tk/GCV组(联合治疗组),每日腹腔注射给药,连续治疗7 d后检测瘤块质量,计算抑瘤率并进行常规组织病理学检查。以不同浓度人参总皂苷与更昔洛韦(GCV)分别或共同作用于B16tk-细胞,以及含20%B16tk+细胞的tk+和tk-混合细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组存活率,用金正均q值法分析人参总皂苷与自杀基因系统联合的相互作用是否具有协同性。【结果】各治疗组瘤块质量均较模型对照组低,联合治疗组的抑瘤率最高(32.29%),该组瘤体质量与模型组比较差异具有显著性意义(P<0.05);人参总皂苷、tk/GCV组的抑瘤率次之,其瘤体质量与模型组比较差异无显著性意义(P>0.05);MTT检测结果显示:单独人参总皂苷对B16细胞的抑制程度不高,各浓度人参总皂苷联合tk/GCV作用72 h所得的金正均q值均小于1.15;肿瘤组织的病理切片结果显示人参总皂苷组和联合治疗组的淋巴细胞浸润程度明显高于模型组。【结论】人参总皂苷能够提高自杀基因系统对黑色素移植瘤的旁杀伤效应,其增效机制可能是通过机体的免疫调节途径实现。

UQCRB基因的原核表达和纯化

目的为研究UQCRB(ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)与中药的作用机制,本实验室进行了UQCRB基因的克隆、原核表达和纯化。方法提取人肝癌SMMC-7721细胞总RNA,反转录后采用特异引物进行PCR扩增获取UQCRB基因全长,产物纯化后连入T载体测定正确,克隆经NheI、XhoI双酶切后连入PET28a(+)载体,构建PET28a(+)-UQCRB原核表达质粒。在BL21(DE3)宿主菌中表达超声处理后,应用Amicon○R Pro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA纯化,表达及纯化产物用westernblot验证。结果构建了PET28a(+)-UQCRB表达质粒,经过酶切鉴定和测序鉴定正确。重组UQCRB在BL21(DE3)中的最优表达条件为IPTG 1mM诱导5h。Westernblot证实了表达和纯化结果。结论重组UQCRB的原核表达和纯化成功,为进一步研究UQCRB的作用奠定了基础。