建立稳定表达人RANTES基因的夏枯草细胞克隆

为了在中药细胞中表达人源有用基因 ,以增强其特异药理活性 ,将克隆自人外周血淋巴细胞 (PBL)mRNA的RANTES基因经Ti质粒衍生的中间表达载体pROKII导入携带pAL44 0 4质粒的根癌农杆菌LBA44 0 4菌株中 ,并采用叶盘共培养法转化离体培养夏枯草细胞 ,经Southern杂交确认RANTES基因在转化细胞基因组中的整合 ,用RT -PCR扩增、Western印迹杂交和酶联免疫吸附测定 (ELISA)分析转化细胞中RANTES基因的表达 ,以PBL的过氧化物酶活性作为重组RANTES对细胞趋化性诱导的检测指标。结果表明 ,RANTES基因已在转基因夏枯草细胞中整合 ,并已形成稳定表达RANTES基因的细胞克隆 ,为进一步培育具有特异药理活性的转基因夏枯草植株打下了基础。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因克隆、可溶性表达及突变体活性分析

为了建立以代谢酶类为靶点的新型抑制剂乃至抗疟药高通量筛选和体外评价平台,从恶性疟原虫海南株FCC1中扩增出乳酸脱氢酶基因(PfLDH)。利用融合表达载体pGEX-2TK和pET-29a(+)将PfLDH基因导入大肠杆菌BL21和BL21(DE3)中高效表达,结果成功地在菌体裂解上清液中检测到高酶促活性的PfLDH。以pGEX-2TK为载体的PfLDH基因主要以包涵体形式表达,以pET-29a(+)为载体的PfLDH基因则能大量表达可溶性PfLDH,表明后者更适合用来大量制备重组PfLDH。同时,根据SDS-PAGE图谱并结合序列分析结果,对基因扩增中随机产生的PfLDH截短序列进行了筛选和克隆,从中获得4个携带终止突变并分别编码45、80、149和263个氨基酸残基的“提早成熟”基因PfLDH-Δ271、-Δ236、-Δ167和-Δ53。通过基因表达及酶促活性测定,评价了提前终止突变对PfLDH活力的影响,为探讨PfLDH结构与功能的关系提供了依据。

青蒿素合成cDNA和新EST的克隆及其低温诱导表达的定量分析

为了开展基于青蒿发育特异及环境诱导转录物组学的新基因分离与鉴定,本研究采集经低温处理的盛花期青蒿(Artemisia annua)叶片提取总RNA,并进行全长cDNA表达序列标签(expres sedsequence tags,EST)克隆,经测序和同源性检索后提交GenBank.在已注册的75个序列中,共有4个全长cDNA与青蒿已知基因高度同源,其余71个EST在青蒿基因中无测序记录,但其中有34个序列与其他植物基因同源,包括24个已知蛋白编码序列和10个未知蛋白编码序列,另外37个序列在任何植物基因中均无测序记录,为首次克隆的植物新基因.为了研究青蒿基因对极端环境胁迫的响应模式,采用半定量PCR(semi-quantitative PCR,SQ-PCR)对冷处理前后青蒿试管苗中青蒿素合成基因ADS,CYP71AV1和CPR的表达水平进行了测定.结果显示,ADS和CYP71AV1基因受冷胁迫强烈诱导,但CPR基因未受明显影响.同时还发现这种冷胁迫诱导作用可被Ca2+通道抑制剂氯化镧(LaCl3)或Ca2+螯合剂EGTA所阻遏,表明Ca2+-CaM信号转导通路可能参与冷胁迫诱导ADS和CYP71AV1基因的表达.对冷胁迫青蒿试管苗的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)测定结果表明,CaM基因的表达水平上调2.5倍,从而印证了上述CaM介导信号转导与冷胁迫诱导基因表达之间相关的推论.利用RFQ-PCR对7个新分离青蒿EST进行了功能注释,结果显示,D/LTSRP,UBE,AR/DAP和POD1基因的冷胁迫诱导表达水平分别上调约8.0,5.0,2.3和1.5倍,而CHI和RGP基因的表达无明显上调或下调.本研究首次在转录水平上对青蒿素合成基因及青蒿新EST的冷胁迫诱导表达模式进行了初步探讨,有助于深入了解青蒿素合成与累积的内在规律及其协同调节机制,为促进青蒿的遗传性状改良及代谢工程指导的育种工作打下基础.

重组人乙型肝炎病毒S基因表达的体内外评价

目的 构建能表达乙型肝炎病毒 (HBV)S基因的DNA疫苗 ,并在离体与活体条件下评价重组S基因的表达。方法 将克隆的S X基因片段插入真核细胞表达载体 ,获得重组质粒 ,在离体转录系统与转染细胞系中表达重组S基因 ,并在小鼠中评价HBsAg激发抗 HBs的效果。 结果 S基因的表达已通过Northern印迹杂交、Western印迹杂交和ELISA(抗原及抗体检测 )予以证实。结论 S基因已成功地实现体外重组与表达。