皮耐克组织工程皮肤修复皮肤创面的研究

【目的】探讨采用皮耐克真皮支架与大鼠表皮干细胞、成纤维细胞构建组织工程皮肤修复皮肤缺损的可行性。【方法】分离培养大鼠表皮干细胞、成纤维细胞并进行免疫荧光鉴定。成纤维细胞接种于皮耐克敷料构建类真皮,表面种植表皮干细胞构建组织工程皮肤。将BALB/c裸鼠复制背部皮肤缺损模型,随机分为3组,单纯支架组移植皮耐克敷料,成纤维细胞支架组移植皮耐克成纤维细胞复合物,组织工程皮肤组移植皮耐克组织工程皮肤。术后记录创面愈合情况,并分别取5、7 d创面组织进行病理学检查。【结果】表皮干细胞角蛋白15(CK15)、β1整合素表达阳性,成纤维细胞层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)表达阳性。组织工程皮肤组愈合情况最好,移植物处成纤维细胞增生,新生毛细血管明显,表皮细胞分层排列规则。【结论】皮耐克组织工程皮肤促进裸鼠皮肤创面修复效果良好。

金钗石斛生物碱对糖性白内障大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的调控

目的探讨金钗石斛生物碱对半乳糖所致糖尿病性白内障大鼠晶状体中一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性及其基因表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、样品高、低剂量组和阳性对照组,每组10只,模型组腹腔注射D-半乳糖诱导大鼠白内障模型,样品高、低剂量组和阳性对照组在注射D-半乳糖26d后形成Ⅱ级白内障后每天分别给予0.36、0.18g/kg金钗石斛总生物碱灌胃进行实验性治疗,阳性对照组每天以0.22g/kg石斛夜光丸灌胃,正常对照组每天仅灌胃生理盐水;用裂隙灯观察观察晶状体浑浊度;46d后处死动物后取晶状体,硝酸还原法测定NO的含量、比色法检测NOS的活性,提取各组晶状体RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测iNOS基因的表达。结果金钗石斛生物碱治疗组和正常对照组、阳性对照组的NO浓度及NOS的活性均显著低于模型组,实时定量PCR表明金钗石斛生物碱可下降iNOS基因的表达。结论金钗石斛生物碱能有效抑制iNOS基因的表达,对糖尿病性白内障具有较好的治疗作用。

龙血素A对体外培养的毛囊干细胞增殖分化的影响

【目的】探讨龙血素A对体外培养的毛囊干细胞(FSCs)增殖和分化的影响。【方法】分离培养SD乳鼠的FSCs,采用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态,并进行I型跨膜糖蛋白(CD34)、转铁蛋白受体(CD71)免疫荧光鉴定。将FSCs分为正常对照组、阳性对照组(Li Cl组)、龙血素A组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测3组细胞的增殖,免疫荧光法检测3组细胞角蛋白15(CK15)、CK19、CK14、CK10、Involucrin的表达率。【结果】倒置显微镜、扫描电镜下观察到培养的FSCs细胞结构完整,生长状况良好,呈CD34、CD71阳性。MTT检测结果提示龙血素A对FSCs促增殖作用最强、Li Cl次之。龙血素A组CK15表达高于正常对照组和Li Cl组。正常对照组CK19表达高于其他2组。CK14 3组表达率相近。龙血素A组Involucrin表达率最高、CK10表达最低,而Li Cl组Involucrin表达最低、CK10表达最高。【结论】龙血素A促FSCs增殖效果明显,氯化锂促FSCs分化效果明显。

龟板提取物调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究

目的探讨龟板提取物是否能够通过调控同源盒基因Otx2(orthodenticle homeobox 2)来促进神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向多巴胺神经元的分化。方法分离培养孕14 d左右的SD胎鼠NSCs 7 d,随机设空白对照组和30μg·m L^(-1)的龟板有效成分PTE(2B)组、龟板提取物十八酸乙酯(S6)组、4-甾酮(S9)组,诱导分化5~7 d,用免疫荧光法检测多巴胺酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元和Otx2的表达,用实时荧光定量PCR法检测Otx2的m RNA表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测Otx2的蛋白表达。结果与空白对照组比较,2B组、S6组和S9组Otx2和TH的荧光表达均升高(P<0.05),S6组Otx2的m RNA表达升高(P<0.05),S6组和S9组Otx2的蛋白表达升高(P<0.05)。结论龟板提取物可能通过调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化。

毛囊细胞高效分离培养方法的建立

【目的】建立一种简单易行、高效稳定、细胞活性好的毛囊细胞分离培养方法。【方法】无菌条件下剪下SD乳鼠触须部皮肤,拔出单个毛囊。采用Ⅰ型胶原酶、胰酶两步法消化毛囊,细胞悬液接种于细胞外基质包被的培养板中,以体积分数1%胎牛血清的K-SFM培养液培养,次日换无血清培养液。剩余组织块剪碎铺展于培养瓶中,添加含血清的HG-DMEM培养基常规培养。取以上2种细胞进行免疫荧光鉴定。毛囊上皮细胞进行流式细胞仪检测。【结果】两步酶法分离得到的毛囊上皮细胞贴壁迅速,圆形或多角形,呈典型铺路石状。培养的组织块周围有长梭形细胞爬出,细胞有突起,并连接成网状。毛囊上皮细胞CK15、CK19、β1整合素表达阳性,以G1期细胞为主,占75.6%。毛囊结缔组织鞘细胞的层粘连蛋白、纤维连接蛋白、波形蛋白表达阳性。【结论】分离培养的细胞为毛囊干细胞和成纤维细胞,该方法得到的细胞贴壁快、均一性好、增殖能力强。