血管抑制素基因真核表达载体的构建及转染研究

目的：构建血管抑制素(angiostatin,AG)基因真核细胞表达载体并进行转染研究。方法：根据已发表的血管抑制素基因的核苷酸序列，设计并合成一对引物，以鼠的纤溶酶原核酸为模板进行PCR扩增，将其基因克隆到真核表达载体pRC／CMV中，进行序列分析和酶切鉴定后，运用脂质体将重组质粒pRC／CMV-AG转入胰腺癌SW1990细胞中，观察其表达情况,以及其对血管内皮细胞生长的作用。结果：PCR扩增出一长1.4 kb的片断，酶切和序列分析证明含完整的AG基因序列，与已知的血管抑制素基因的同源性很高（>96％）。Western blot证实重组体pRC／CMV-AG有较高的表达，对血管内皮细胞的生长有一定的抑制作用。结论：重组体pRC／CMV-AG是一种高效真核表达载体；克隆的AG基因能抑制血管内皮细胞的生长。

葡萄胎发病相关新基因的克隆

目的筛选和克隆与葡萄胎发病相关的新基因。方法采用抑制性消减杂交方法,建立葡萄胎组织与正常早孕绒毛组织间的差示cDNA文库,从中筛选出新基因序列,并克隆其全长。结果从差示cDNA文库中共筛选出28个克隆,测序结果提示含10种基因序列,其中3个基因片段被确认为功能未明的新基因,并获得其中一条基因的全长序列(按克隆序列号命名为F10)。结论F10等新基因可能与葡萄胎的病理发生发展密切相关。

采用消减杂交初步筛选先兆子痫病理相关基因

目的 应用抑制性消减杂交、PCR技术 ,克隆出与先兆子痫有关的高表达基因和 (或 )新基因。方法 分别从正常妊娠分娩胎盘和先兆子痫患者分娩胎盘中提取mRNA ,采用抑制性消减杂交、PCR技术 ,构建先兆子痫胎盘cDNA文库 ,采用反向杂交验证 ,测序分析 ;以初步筛选的差异表达基因为探针 ,与先兆子痫和正常胎盘总体mRNA斑点杂交。结果 构建成功具有高消减效率的与先兆子痫相关cDNA消减文库 ,文库扩增后得到 60个阳性克隆 ,经杂交验证 ,有 3 4个阳性克隆有插入片断 ,随机挑取一阳性克隆菌落 ,测序分析发现该差异表达基因为核蛋白多糖基因 ,以该差异表达基因为探针 ,与先兆子痫和正常胎盘总体mRNA斑点杂交 ,观察其在总体胎盘中的表达。结论 人类先兆子痫胎盘基因表达同正常胎盘相比 ,核蛋白多糖呈差异表达基因 。