环境化学致癌研究若干热点与问题

环境化学物的致癌机制研究是环境与健康研究的一项重要内容,广州医学院化学致癌研究所蒋义国教授从事环境化学致癌和分子毒理学研究并取得重要进展。本刊特邀蒋义国教授就近期研究成果组织和整理,进行集中报道,以促进该研究的深入和发展。

Musashi-1基因启动子区域-2297T>C多态与人群食管癌的易感性

目的:研究Musashi-1基因(MSI-1)启动子区-2297T>C(rs3742038)多态与我国人群食管癌发病的关联。方法:应用病例对照研究方法,采用Taqman技术检测300对食管癌病例的基因与正常对照-2297 T>C多态位点的基因型,并用SAS9.13软件分析该位点变异与食管癌易感性的关联。结果:以-2297TT基因型携带者为参照,携带C变异基因型(-2297CT/CC)个体发生食管癌的风险将显著增加(adjusted OR=2.27;95%CI=1.29-4.02),且随着变异等位基因个数增加,食管癌发病风险呈剂量—效应关系地增加(P_(trend)=0.0088)。结论:MSI-1基因启动子区-2297T>C基因变异型能显著增加我国人群发生食管癌的风险性,将为食管癌高危人群的筛选提供重要的遗传标志。

NBS1基因8360G＞C(Glu185Gln)多态位点与南方人群肺癌的相关性

目的:研究DNA双链断裂修复基因NBSl编码区8360G>C(Glu185Gln)多态与我国南方人群肺癌发病的关联。方法:应用病例对照研究方法,采用PCR-RFLP技术检测300例肺癌患者与正常对照8360G>C多态位点的基因型,用SAS9.13软件分析该位点变异与肺癌发病的关系。结果:NBSl的8360G>C基因型频率在肺癌与对照中的分布差异有显著性(P=0.0230);携带GC变异基因型个体发生肺癌的危险性是GG基因型携带者的1.28倍(adjusted OR=1.28;95%CI=1.04-1.59;P=0.025),携带CC变异基因型个体的危险性则是1.93倍(adjusted OR=1.89;95%CI=1.43-2.51;P<0.001),且存在显著的等位基因剂量-效应关联(P_(trend)=0.0049)。结论:NBSl编码区8360C变异基因型与我国南方人群肺癌发病有关,它可能是我国南方人群肺癌发病的一个遗传相关因素。

尼古丁受体3基因启动子多态与被动吸烟者发生肺癌的易感性研究

目的:探讨被动吸烟人群尼古丁受体3基因(CHRNA3)启动子区遗传变异与肺癌发病的关系。方法:用病例-对照的研究方法,收集250例被动吸烟原发性肺癌患者和250例性别相同、年龄相差±1岁被动吸烟正常对照,采用PCR-RFLP技术检测CHRNA3基因启动子单核苷酸多态位点rs6495309(T>C)的基因型,用SAS 9.13软件进行非条件Logistic回归校正混杂因素的影响,分析基因变异与肺癌发病的关联。结果:基因型频率分析均符合Hardy-Weinberg平衡,P=0.109 6;CHRNA3 rs6495309(T>C)位点变异在肺癌与对照中的分布差异有统计学意义,P=0.043 2;携带CC基因型个体发生肺癌的危险性较TT基因型个体增加81%(95%CI=1.07～3.06;P=0.019);rs6495309C变异基因型(rs6495309TC和rs6495309CC)患肺癌的危险性增加(adjusted OR=1.63;95%CI=1.06～2.50;P=0.025)。发现被动吸烟来自于父母人群时该位点变异在肺癌与对照中分布差异有统计学意义,P=0.047 9。结论:CHRNA3基因启动子rs6495309(T>C)变异的被动吸烟人群肺癌发病危险性较高,且其危害性主要表现为被动吸烟来源于父母的人群。

miR-542-3p在反式-7，8-二羟-9，10-环氧苯并芘诱导致癌中的作用

目的 探讨反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘（anti-BPDE）诱导恶变的人支气管上皮细胞（16HBE-T）中miR-542-3p在细胞恶性转化中的作用.方法 运用实时荧光定量PCR法验证miR-542-3p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞（16HBE-N）中的表达水平.瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平,检测miR-542-3p表达水平改变对16HBE-T细胞的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、软琼脂克隆形成率及细胞迁移能力的影响.结果 转染前16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是16HBE-N的（39.08±6.95）%（t=15.18,P＜0.05）.瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平后,16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是转染前的（5.23±0.55）倍（t=17.37,P＜0.05）.miR-542-3p模拟物组（mimic组）与16HBE-T组（100%）相比,增殖率下降到（62.06±5.61）%（t=-17.28,P＜0.05）,G0/G1期比例上升到（74.76±4.86）%（t=4.53,P＜0.05）,克隆形成率降低为（5.87±0.67）%（t=-6.66,P＜0.05）.mimic组生长细胞覆盖区面积比（0.31±0.08）明显降低（t=-6.78,P＜0.05）,凋亡无改变.结论 miR-542-3p表达水平升高会降低anti-BPDE恶性转化细胞的增殖能力和恶性程度,推断miR-542-3p是类抑癌基因,在anti-BPDE诱导致癌过程中低表达的miR-542-3p可能是促成恶性转化的重要因素.

miR-17-5p与反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导转化的人支气管上皮细胞生物学特性的关系研究

目的探讨miR-17-5p对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)的生物学特性方面的影响。方法运用逆转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-17-5p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)的相对表达水平。通过瞬时转染miRNA模拟物及抑制剂,改变16HBE-T中miR-17-5p的表达,分析转染后16HBE-T的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡和软琼脂集落形成率等。结果转染前,16HBE-T中miR-17-5p表达水平是16HBE-N的2.35倍;转染后,转染miR-17-5p抑制剂组和转染miR-17-5p模拟物组中的miR-17-5p表达水平分别是16HBE-T的0.45和1.71倍。与抑制剂阴性对照组相比,转染了miR-17-5p抑制剂的试验组出现增殖能力下降、细胞周期阻滞和凋亡上升、克隆形成率下降。相反,转染了miR-17-5p模拟物的试验组与模拟物阴性对照组相比出现了增殖能力上调、凋亡减少,克隆形成率升高。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-17-5p成熟体表达水平改变能够影响16HBE-T的增殖能力、细胞周期和凋亡、克隆形成率,推断miR-17-5p在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。

急性肾损伤RIFLE与AKIN标准在重症监护病房患者的应用比较

目的比较急性肾损伤（AKI）RIFLE标准（危险、损伤、衰竭、肾功能丧失、终末期肾病）与急性肾损伤网络工作小组（AKIN）诊断标准在重症监护病房（ICU）成人患者中的应用价值。方法收集广东省人民医院ICU2009年10月至2010年7月成人患者的病历资料。分别采用RIFLE标准与AKIN标准对ICU中AKI及其严重程度进行定义分期，比较两种标准诊断的敏感性及预测院内病死率的准确性。结果共人选患者524例，其中符合RIFLE标准的AKI95例，符合AKIN标准的AKI135例，两种标准在判断ICU患者AKI的发生率方面差异有统计学意义（18．1％比25．8％，P〈0．05）。AKI为院内死亡的独立危险因素；RIFLE标准预测患者院内死亡的受试者工作特征曲线（ROC曲线）下面积（AUC）为0．7293，95％可信区间（95％CI）为0．6005～0．8581，P〈0．001；AKIN标准预测患者院内死亡的AUC为0．7777，95％CI为0．6664～0．8890，P〈0．001；二者诊断AKI的预测能力比较差异无统计学意义（37．9％比34．1％，P〉0．05）。结论与RIFLE标准相比，AKIN标准在诊断ICU成人患者AKI的发生方面更敏感，但是在预测院内死亡方面并未体现优势。

结晶型硫化镍对人支气管上皮细胞PTEN基因和miR-22表达的影响

目的分析结晶型硫化镍(NiS)诱导转化人支气管上皮细胞第35代(16HBE-T35)及其前期第18代细胞(16HBE-T18)PTEN基因及miR-22的表达水平,探讨PTEN基因与miR-22在化学致癌过程中的相互关系。方法以16HBE-T35和16HBE-T18细胞为实验组,蒸馏水处理组分别为其相应的对照细胞(16HBE-N35和16HBE-N18),用茎环结构逆转录引物实时定量RT-PCR检测4种细胞miR-22成熟体表达量。运用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测四种细胞PTEN mRNA和蛋白表达量。结果 16HBE-T18细胞和16HBE-T35细胞中miR-22的表达水平分别是16HBE-N18细胞的(0.27±0.09)倍和(3.50±0.31)倍。16HBE-T35细胞的PTEN蛋白表达水平是16HBE-N35细胞的(0.48±0.26)倍,但16HBE-T18细胞和16HBE-N18细胞之间PTEN蛋白表达水平无明显差异。结论在NiS诱导的恶性转化细胞16HBE-T35中,PTEN蛋白表达水平下降,而miR-22表达水平增高。恶性细胞中,miR-22可能在转录后影响PTEN蛋白的表达。

反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导恶变细胞中miR-494和miR-22的功能及PTEN的表达

目的分析反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化人支气管上皮细胞第30代(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15)miR-494及miR-22的表达水平,探讨其在化学致癌过程中的作用及对靶基因PTEN抑癌基因的调控。方法以16HBE-T30和16HBE-T15细胞为实验组,溶剂处理组分别为其相应的对照组细胞(16HBE-N30和16HBE-N15),用茎环结构逆转录引物定量RT-PCR检测四组细胞miR-494及miR-22成熟体表达水平。运用定量RT-PCR和Western blotting分别检测四组细胞PTEN mRNA和蛋白表达水平。运用miRNA前体及抑制剂对miNRA表达进行调控后,再检测PTEN的表达改变,并进行报告基因信号改变、细胞凋亡、软琼脂集落形成率等分析。结果 16HBE-T30中miR-494和miR-22表达水平分别是16HBE-N30的12.6和2.3倍,而16HBE-T15中miR-494、miR-22表达水平较16HBE-N15下降。16HBE-T30中PTEN蛋白表达量低于16HBE-N30。与前体阴性对照组相比,上调的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量降低至0.8和0.5倍,而降低的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量上调至1.3和1.5倍。在16HBE-T30细胞中,miR-494和miR-22表达下调均增强caspase-3/7活力,miR-494和miR-22表达上调则减弱其活力。miR-494和miR-22下调能够降低转化细胞的恶性程度。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-494和miR-22在转录后水平反向调控靶基因PTEN的表达,这两种miRNA在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。

苯并[a]芘暴露的小鼠原代支气管上皮细胞中miR-320对细胞周期的影响

目的检测miR-320在苯并[a]芘(B[a]P)暴露的小鼠原代支气管上皮细胞的表达水平,探讨B[a]P染毒的小鼠支气管上皮细胞中miR-320对细胞周期的影响。方法以1.00μmol/LB[a]P染毒原代培养小鼠支气管上皮细胞。以定量PCR检测染毒细胞中miR-320的表达。以FACSArray流式液相芯片分析仪检测细胞周期和细胞周期素依赖性激酶6(CDK6)的表达水平。结果 miR-320在B[a]P染毒细胞中表达上调。染毒细胞出现G1期阻滞现象,与溶剂对照组的[(62.70±1.54)%]G1期细胞比例相比,(84.28±0.36)%的细胞停留在G1期。抑制miR-320表达后G1期阻滞现象缓解。染毒细胞中的CDK6表达降低,抑制miR-320表达后,与B[a]P组相比,CDK6的表达量有(2.0±0.3)倍的升高。结论 miR-320在一定程度上通过对CDK6表达的调控影响B[a]P暴露的细胞的细胞周期。

肺癌与人微小RNA miR-499-3p种子序列遗传变异关系

目的探讨人微小RNA hsa-miR-499-3p种子序列1个常见单核苷酸多态位点（rs3746444 A〉G）的遗传变异与中国南方人群肺癌发病的关联。方法以病例-对照研究方法收集原发性肺癌患者526例及正常对照526人,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态（PCR-RFLP）技术检测hsa-miR-499-3p种子序列的单核苷酸多态（rs3746444 A〉G）的基因型,用SAS 9.13软件进行非条件Logistic回归,校正混杂因素影响,分析基因变异与肺癌发病的关联。结果以携带野生型纯合子rs3746444AA基因型为参照,携带AG基因型个体发生肺癌的危险度可增加32%（校正OR=1.32,95%CI=1.01-1.84）,携带GG基因型的个体患肺癌的危险度增加122%（OR=2.22,95%CI=1.52-3.23）,且rs3746444 G变异的等位基因个数与肺癌发病危险呈剂量-效应关系（趋势性检验P=3.04×10-5）。结论 hsa-miR-499-3p种子序列（rs3746444 A〉G）遗传变异可增加人群肺癌发病的危险性。

自噬途径对反式-BPDE诱导人支气管上皮细胞16HBE影响及其机制的探讨

目的:研究反式-BPDE诱导正常的人支气管上皮细胞16HBE发生恶性转化前后自噬水平的变化及其可能机制。方法:利用前期建立的细胞恶性转化模型,采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术,在无损伤状态下,实时观测反式-BPDE恶性转化细胞(16HBE-T)和正常细胞(16HBE-N)中自噬体标记蛋白GFP-LC3的荧光强度及定位,并利用蛋白质印迹法技术检测细胞内自噬信号通路关键效应分子的表达。结果:16HBE-T细胞与16HBE-N细胞相比,GFP-LC3蛋白的点状聚集明显减少,只有16HBE-N细胞的1/3左右,表明自噬水平下降,蛋白质印迹法检测发现,mTOR激酶活性上升,Beclin 1表达下降。结论:反式-BPDE可能通过自噬途径参与诱导16HBE细胞恶性转化的癌变过程,将为预防和治疗肺癌提供重要信息。