自身免疫性溶血性贫血研究进展

自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是由于各种原因导致抗自身红细胞抗体的产生,红细胞破坏加速,寿命缩短而导致的一种贫血,为一类临床常见且极难根治的血液病。探究其病因,病理机制,自身抗体的型别,IgG亚型及其临床意义及有效治疗方法,具有重大的临床价值。现就诸方面进展综述如下。

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠,观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论反义LMP1能成功抑制LMP1的表达,逆转NPC细胞的恶性表型,为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。

川崎病患儿血清抗血管内皮细胞抗体检测的临床意义

目的探讨抗血管内皮细胞抗体(AECA)检测在川崎病(KD)早期诊断及体液免疫状况方面的临床意义。方法检测58例KD急性期患儿和43例对照组(其中普通发热对照23例,健康对照20例)儿童的血清AECA-IgG、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4,计算各组AECA的阳性率,进而分别比较AECA阳性KD组、AECA阴性KD组与对照组的上述指标的浓度差异。结果①KD患儿AECA-IgG的阳性率为39.7%,明显高于健康对照组的5.0%(P<0.01),也高于发热对照组的17.4%,但无统计学差异(P>0.05);②AECA阳性组与AECA阴性组IgG、IgM、IgA、C3浓度均分别明显高于发热对照组和正常对照组(P<0.05),C4水平只有AECA阳性组明显高于发热对照组和健康对照组(P<0.05),但AECA阳性组与阴性组间上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论血清抗内皮细胞抗体在川崎病患儿中有较高的阳性率,具有一定的早期辅助诊断价值。川崎病急性期存在着明显的体液免疫异常,IgA介导的体液免疫可能在其中扮演着重要角色。

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的 构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法 通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果 扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论 成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 。

EB病毒LMP1蛋白CTAR23结构域的原核表达及纯化

目的获得纯化的LMP1CTAR23结构域蛋白。方法用RT-PCR方法从B95-8细胞中扩增EBVLMP1CTAR23结构域的cDNA,将其克隆至PGEM-Teasy载体后进行测序鉴定。亚克隆至原核表达载体PGEX-6P-3,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组菌株表达。用SDS-PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定,用Sepharose4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果扩增的LMP1CTAR23长度为357bp,测序结果与已知序列吻合。获得PGEX-6P-3-CTAR23原核表达菌株,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约42000u的PGEX-6P-3-CTAR23融合蛋白,分离纯化出约13000u的LMP1CTAR23蛋白。结论成功获得EBVLMP1CTAR23蛋白,为研究LMP1致瘤机制,研制生物抗癌药物奠定基础。

板蓝根对试验性小鼠遗传毒性的影响

目的 :研究板蓝根水煎液在实验性小鼠体内是否具有遗传毒性。方法 :应用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形实验 ,观察板蓝根水煎液在小鼠体内能否诱发体细胞和雄性生殖细胞遗传物质的损伤。结果 :板蓝根水煎液能明显诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和小鼠精子畸形 ,具有致突变作用。结论 :板蓝根水煎液作为一种临床常用的清热解毒和治疗肿瘤的中草药 ,在剂量较大时 ,具有致突变性 ,临床使用上应注意。

改革考试命题形式,加强素质教育

改革考试命题模式是加强素质教育的一个重要环节。本文在论述应试教育带来的负面影响的基础上，提出要转变观念，强化素质教育意识；改革试题的命题形式，充分体现理论联系实际。

恒河猴IL-4与变异IL-4促进外周血单核细胞向树突状细胞转化功能的比较

【目的】比较重组的恒河猴IL-4与变异IL-4在促进外周血单核细胞向树突状细胞转化方面功能的异同。【方法】利用葡聚糖-泛影葡胺梯度离心法分离恒河猴外周血单个核细胞,阴性筛选非CD3+细胞,随后贴壁分离外周血单核细胞并进行流式细胞技术确定筛选结果。将所分离的外周血单核细胞分为阴性对照组,IL-4+GM-CSF组和vIL-4+GM-CSF组进行体外培养,收集细胞并表面染色CD14、CD1a、CD11c和CD83进行流式细胞分析。【结果】利用三步分离的方法得到了纯度达90%的未激活的外周血单核细胞。培养后的细胞进行流式分析,结果提示与阴性对照组相比,IL-4+GM-CSF组和vIL-4+GM-CSF组细胞的CD14表达明显下降,而CD1a、CD11c和CD83表达明显上调,两实验组间无差别。【结论】与IL-4相同,vIL-4亦能促进外周血单核细胞转化为树突状细胞。

湖北省不同年份汉坦病毒的RT-PCR检测及分型

目的:探讨湖北省不同年份引起肾综合征出血热的汉坦病毒的主要型别,为进一步研究该型汉坦病毒的基因变异打下基础。方法:根据汉坦病毒M基因片段G1编码区核苷酸序列设计Ⅰ型和Ⅱ型分型引物,利用RT-PCR时105份不同年份的病程在7日以内的肾综合征出血热(HFRS)患者(经临床诊断和ELISA确诊)血清标本进行检测及基因分型,并对扩增出的基因片段选用3种限制性内切酶Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ、Mbo Ⅰ进行酶切分析。结果:用Ⅰ型引物通过RT-PCR检测75份血清标本(1996-2000年)和30份血清标本(1986-1987年)的阳性率分别为77.3％和10％,而用Ⅱ型引物检测前者阳性率为8.0％,后者均为阴性。对4份Ⅰ型引物扩增产物用3种限制性内切酶进行酶切分析,发现4份阳性产物其限制性片段长度多态性均与Ⅰ型汉坦病毒标准株76-118完全不同,但其中3份与Ⅰ型汉坦病毒湖北地方株HV114相同,1份与HV114不完全相同。结论:不同年份引起湖北地区HFRS的主要毒株均为Ⅰ型汉坦病毒(HTN)湖北地方株。

日本血吸虫TGF-β1成熟肽编码序列的克隆、表达及其转录水平

目的获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)转化生长因子β1(TGF-β1)成熟肽基因的DNA,进行原核克隆和表达,并比较它与Sj26kd的谷胱甘肽转移酶(Sj26GST)在成虫和虫卵期的转录水平。方法根据美国国立生物信息学中心(NCBI)上登录的小鼠TGF-β1基因的全长序列,设计两条位于保守区的寡核苷酸作为引物,利用RT-PCR从日本血吸虫成虫的mRNA中扩增SjTGF-β1基因的部分序列,并利用生物信息学进行分析和鉴定。克隆SjTGF-β1成熟肽基因的cDNA到原核表达载体pGEX-6p-3,将重组载体转化大肠杆菌BL21株并诱导表达。利用RT-PCR半定量分析SjTGF-β1基因与Sj26GST基因在成虫和虫卵期的转录水平。结果成功获得并构建了SjTGF-β1成熟肽基因的原核表达载体。融合表达后的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为35000,与目的基因编码蛋白的预测分子量相符。SjTGF-β1在成虫与虫卵期的转录水平都低于Sj26GST基因,但虫卵期的转录水平比成虫高。结论SjTGF-β1成熟肽基因的获得为其编码序列全长的获得奠定了基础;重组融合蛋白的成功表达为进一步的功能研究提供保障;虫卵期该基因的转录水平高提示该基因在血吸虫虫卵与宿主的相互作用中可能具有一定的作用。

谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素融合蛋白表达载体的构建

目的 构建谷胱甘肽S转移酶 -血管生成抑制素 (GST -Angiostatin)融合蛋白表达载体。方法 把血管生成抑制素 (Angiostatin)基因插入融合基因表达载体pGEX - 2T的多克隆位点上 ,转化大肠杆菌DH5α ,提取质粒DNA ,限制性内切酶消化DNA ,琼脂糖凝胶电泳。结果 经限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ酶切质粒DNA ,电泳结果证明Angiostatin基因已插入到pGEX - 2T中。结论 成功构建GST -Angiostatin融合蛋白表达载体 ,为获得较大量的基因工程Angiostatin产品 ,为肿瘤治疗研究作必要准备。

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术，即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列，然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中，以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定，确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。

日本血吸虫感染BALB/c小鼠脾脏细胞学的变化

目的观察BALB/c小鼠感染日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)6～8周后脾脏细胞学的改变情况。方法用日本血吸虫尾蚴腹贴法建立日本血吸虫感染的小鼠模型。6～8周后观察肝脏、脾脏大小,称重;做脾脏淋巴细胞计数;用流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞的大小、密度和T、B细胞分类以及Th细胞亚群情况;用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)所诱导的特异性抗体IgG的产生情况。结果日本血吸虫感染BALB/c小鼠6～8周后,脾脏体积明显增大,重量增加,细胞数量明显增多。流式细胞仪检测发现脾脏中出现一群体积明显增大的细胞群,该群细胞表达少量的CD4、CD8、CD19和DX-5分子;Th1/Th2轴发生偏移,Th17细胞数量增多;ELISA结果表明血清中SEA特异性抗体IgG水平明显升高。结论日本血吸虫感染的BALB/c小鼠脾脏出现明显的细胞学改变,尤其是Th1细胞数目下降,浆细胞、Th2细胞及Th17细胞数目增多,为研究日本血吸虫感染后期虫卵肉芽肿形成的免疫病理机制奠定了基础。