对医学院校《生物毒素学》教学的实践与思考

在20世纪70年代出现了毒素学（Toxinology）的新词语,它表示对生物毒素的研究已经发展、演化成为一个新的学科,其研究重点不再局限于对毒素个体的化学、生物学、毒理学工作,而是从多学科角度对生物毒素进行综合化、系统化地深入研究,其基础研究与应用领域广泛,形成了生命科学中十分活跃的新领域。随着生物毒素研究在医药领域中的广泛开展，我院在药学专业、生物技术专业中开设了《生物毒素学》这门课程，经过近3年的教学实践，笔者对《生物毒素学》教学过程中出现的问题进行分析，并对今后教学改革提出几点思考。

中华眼镜蛇蛇毒组分C诱导白血病细胞凋亡作用的研究

研究眼镜蛇蛇毒组分Ｃ诱导白血病细胞凋亡的作用及机制。方法：应用光学显微镜、透射电镜、脱氧核糖核酸（ ＤＮＡ）电泳、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）等方法，观察白血病细胞经过眼镜蛇蛇毒组分Ｃ处理后，形态学、生物化学及ＢｃＩ－２／Ｂａｘ基因表达水平的变化。结果：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导人粒细胞白血病细胞系（ＨＬ６０）发生凋亡形态学和生物化学变化；流式细胞议分析发现眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能使一定比例的人粒单细胞白血病细胞系（Ｊ６－１）、人红白血病细胞系（Ｋ５６２）、ＨＬ６０。细胞及取自患者骨髓的白血病细胞发生凋亡，而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加；ＲＴ－ＰＣＲ方法检测发现眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能使ＨＬ６０细胞Ｂｃｌ－２基因的表达下调，而Ｂａｘ变化不明显。结论：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导白血病细胞发生凋亡，此作用与Ｂｃｌ－２基因的表达下调有关。

卵黄抗体用于蛇毒抗原检测的初步研究

目的在常规ELISA检测中,以卵黄抗体取代哺乳动物来源的IgG类抗体,以探讨卵黄抗体应用于蛇毒检测的可行性.方法以甲醛减毒的眼镜王蛇毒抗原免疫莱航母鸡,制备抗眼镜王蛇毒抗体;采用过碘酸钠法对特异卵黄抗体进行酶标;将卵黄抗体及相应酶标抗体应用于常规ELISA中,对国内常见蛇毒样品抗原(包括眼镜王蛇毒、眼镜蛇毒、金环蛇毒、银环蛇毒、五步蛇毒及广东园斑蝰蛇毒)进行检测,并进行灵敏度、精确度、特异性及交叉反应等分析.结果检测的灵敏度可达32 μg·L-1,并且眼镜王蛇毒抗原浓度在32～750 μg·L-1的范围内,线性关系较好(r=0.963);初步应用表明卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有较高的特异性,与蝰蛇科的五步蛇毒、园斑蝰蛇毒无交叉反应,与眼镜蛇科的金环及银环蛇毒仅在高剂量(剂量大于500 μg·L-1)时存在轻度交叉反应,不干扰实验检测,但与眼镜蛇毒之间交叉反应明显,干扰实验检测;应用本方法对低(100 μg·L-1)、中(300 μg·L-1)、高(1 000 μg·L-1)不同浓度的眼镜王蛇毒样品检测,结果平均板内变异系数均在1%～3%之内,板间变异系数在8%以内.结论 特异的卵黄抗体应用于微量蛇毒检测研究是可行的,具有灵敏度高、特异性较强等优点.该研究将为蛇伤诊断试剂盒的研制提供相应的理论依据.

蛇毒类凝血酶的研究进展

自1936年Klobusitzki和Konig首次从美洲矛头蝮蛇(Bothrops jararaca)蛇毒中获得部分纯化的类凝血酶以来,迄今已发现三十余种蛇毒中含有类凝血酶组份,并有二十余种先后得到分离和纯化。尤其是近年来,有关蛇毒类凝血酶分子结构及酶学性质的研究取得了很大进展,部分已作为诊断试剂及治疗药物广泛地应用于临床。兹就近年来蛇毒类凝血酶的研究进展作一简要综述。

中华眼镜蛇毒活性组分体外抑制三维血管生成的实验研究

目的研究中华眼镜蛇毒活性组分的抗血管生成作用。方法采用拟血管生成三维培养法,观察活性组分对体外血管生成的抑制效应。结果活性组分可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管网状三维结构的反应,0.6、1.2、2.4μg·ml-1的不同浓度组分抑制程度不同。在0.6μg·ml-1浓度组,培养基质Matrigel中的内皮细胞团只形成局部的、不完整的空间网状结构;在1.2μg·ml-1浓度组,悬浮于凝胶中的细胞团所形成的管芽不能相互连接而形成空间网状结构;在2.4μg·ml-1浓度组,细胞散在悬浮于胶层中大部分不能粘聚,且随培养时间的延长无明显的结构变化。结论中华眼镜蛇毒活性组分具有体外抑制血管生成的生物活性。

中华眼镜蛇毒组分抗白血病作用的实验及初步临床应用研究

目的：研究眼镜蛇组分对白血病细胞的直接作用及临床疗效。方法：应用ＭＴＴ法检测眼镜蛇毒组分对ＨＬ６０等９株白血病细胞系的毒性作用及量效关系；初步观察静脉滴注眼镜蛇毒组分治疗８例恶性血液病患者的效果。结果：眼镜蛇毒组分对９株人白血病细胞系均有明显的抑制作用，ＩＣ５０为０．００６～４４０μｇ／ｍｌ，且呈较好的量效关系（ｒ为０．６６～０．９９；Ｐ＜０．２－０．００１）。初步的临床观察结果显示，一疗程后８例病人中有效６例。其中４例原来应用化疗无效，于原方案第二疗程加用眼镜蛇毒，结果产生了一定的效果。静滴眼镜蛇毒组分未见过敏反应；无凝血因子，血小板功能异常加重的实验指标出现；单用眼镜蛇毒组分时骨髓抑制不明显。主要的不良反应是水样腹泻，尤其是应用Ｍ组分时非常严重，改用Ｃ组分时腹泻明显减轻。结论：眼镜蛇毒组分对多种白血病细胞株具有较强的抑制作用；此种作用与剂量呈正相关。初步的临床观察说明眼镜蛇毒组似有加强化疗药物效果的作用；眼镜蛇组分静注无明显近期毒副反应。

中华眼镜蛇毒组分CⅡ抗耐药K562/A02细胞作用机制的研究

目的:研究中华眼镜蛇毒组分CⅡ(FCⅡNNAV)对多药耐药白血病细胞K562/A02的抑制作用及机制。方法:应用MTT法观察FCⅡNNAV体外对K562和K562/A02的毒性作用,流式细胞仪法观察FCⅡNNAV体外对K562/A02细胞Pgp,Bcl2蛋白表达的影响,比色法检测Caspase3活性变化。结果:FCⅡNNAV对耐药K562/A02及敏感K562细胞均有抑制作用,IC50分别为0.75±0.01μg·ml-1和0.67±0.11μg·ml-1。流式细胞仪检测发现FCⅡNNAV能使K562/A02细胞的Pgp,Bcl2蛋白表达明显下调;Caspase3活性明显增强。结论:FCⅡNNAV对细胞K562/A02及细胞K562均有较强的抑制作用,且抑制作用与剂量呈正相关,FCⅡNNAV可能通过抑制K562/A02细胞Pgp,Bcl2蛋白表达,激活Caspase3活性而诱导K562/A02细胞凋亡。

眼镜蛇毒组份在动物体内外的抗氧化作用研究

目的 :以大鼠组织匀浆及红细胞为材料 ,研究中华眼镜蛇毒组份F和H的抗脂质过氧化作用 ;探讨组份F/H对小鼠体内抗氧化酶活性的影响。方法 :以MDA为指标 ,观察组份F/H对组织匀浆体外脂质过氧化及红细胞自氧化溶血体系脂质过氧化产物MDA生成量的影响 ;观察组份F/H对邻苯三酚自氧化产生的O ·2 及Cu2 + VitC自由基产生系统产生的·OH的清除作用 ;连续 15天腹腔注射组份F/H ,测定小鼠体内SOD、CAT的活性。结果 :组份F/H均能抑制红细胞自氧化 ,显著减少红细胞自氧化过程中MDA的含量 ;组份F/H均可抑制正常大鼠心、肝、脑组织匀浆体外过氧化脂质生成 ,并能对抗Fe2 + Cys激发的过氧化脂质生成增加 ;组份F/H均能清除超氧阴离子 (O ·2 )和羟自由基 (·OH) ,组份H的作用更强 ;组份F/H均能不同程度地增加小鼠体内多种抗氧化酶的含量。结论 :组份F和H具有一定的抗氧化作用 ,能直接清除活性氧自由基 ,提高SOD的活性。

中华眼镜蛇毒组份Ⅲ的药代动力学及组织分布研究

目的 :观察中华眼镜蛇 (Najanajaatra)蛇毒组份Ⅲ在兔体内的药代动力学过程和在小鼠体内的分布状况。方法 :用氯胺 -T法对眼镜蛇毒组份Ⅲ进行碘化标记 ,用放射性核素示踪动力法检测血液中的药物浓度 ,以放射性参与量 (脏器与血液放射比 )的比值作为组份Ⅲ在组织中分布的依据。结果 :兔静脉注射眼镜蛇毒组份Ⅲ 75、15 0和 30 0 μg/kg 3个剂量后 ,快分布相半衰期T1/2 α为 39 6 - 4 2 5min ,慢分布相半衰期T1/2 β为 16 8- 17 3h ,消除相半衰期T1/2 γ为 2 1 7- 2 2 1h。小鼠尾静脉注射 [12 5Ⅰ ]-组份Ⅲ后 ,2h及 4h放射性参与量大于 1的器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和肌肉 ,其中以肾脏分布最高 ,且 4h放射性参与量高于 2h。结论 :兔静脉注射组份Ⅲ 3个剂量后 ,血药 -时间曲线经 3P87药动学程序拟合符合三房室模型特征 ,3个时相的半衰期各剂量组之间无显著差异 ,曲线下面积 (AUC)与剂量成正比 ,表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程。小鼠静注组份Ⅲ后 2h ,以肾脏分布最高 ,肝脏与肺脏的放射性参与量也较高 。

中华眼镜蛇毒组分F的体外抗血管生成活性研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分F对血管内皮细胞黏附功能的抑制作用和体外的抗血管生成活性。方法MTT快速测定法测定组分F对原代培养的血管内皮细胞对纤维蛋白原(Fg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响;采用平面拟毛细血管生成培养法,观察组分F对血管生成的抑制效应。结果组分F可抑制血管内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fg和Matrigel 3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性,组分F对细胞黏附Fg和Matrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05);组分F可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管样网状结构的反应,并且随浓度的不同抑制程度有明显不同。结论中华眼镜蛇毒组分F具有体外抗血管生成活性。

蛇毒类凝血酶的研究进展

本文综述蛇毒类凝血酶研究的最新进展,重点阐述蛇毒类凝血酶分子结 构及酶学特性的研究成果。

检测腹蛇毒的压电免疫传感器的研究

目的将石英晶振的高灵敏度与免疫反应的特异性相结合,研制检测蝮蛇毒的压电免疫传感器方法用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜偶联抗蝮蛇毒球蛋白构建传感器探头结果组成的检测器对蝮蛇毒响应良好。结论采用免疫传感技术将是实现快速、仪器化检测蛇伤的可能途径。

中华眼镜蛇毒活性组分抑血管内皮细胞增殖和黏附实验研究

目的:研究眼镜蛇毒在抗血管生成方面的生物活性。方法:采用Sephadex阳离子交换柱和分子筛分离中华眼镜蛇毒原毒,以MTT法评价和筛选分离各蛋白峰对培养内皮细胞的抑生长活性;MTT快速测定法测定活性峰对内皮细胞与纤维蛋白原(Fbg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响。结果:经两步分离后从中华眼镜蛇毒中获得一可特异性抑制内皮细胞生长的活性蛋白峰,该活性组分可抑制内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fbg和Matrigel等3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性;组分对细胞黏附Fbg和Hatrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05)。结论;眼镜蛇毒中可能含有可抑制血管生成的活性物质,在抗血管生成方面有良好的研究价值。

眼镜蛇毒及蝮蛇毒抗血小板聚集功能的实验研究

蛇毒是毒蛇毒腺分泌的物质,不同种类的蛇毒因其成份不同,故具不同的毒性。本文主要报告蝮蛇毒、眼镜蛇毒在体外对正常人血小板聚集功能的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 蛇毒:蝮蛇毒(江浙产)、眼镜蛇毒(广东产)均由广州蛇毒研究所提供,粗毒活性分别为90％。

国产蛇毒激活血浆蛋白C的研究

目的 :从 9种国产蛇毒中筛选具有激活血浆蛋白C作用的蛇毒。方法 :运用活化部分凝血活酶时间(APTT)和发色底物实验分别观察抗凝活性和酰胺酶活性 ,综合抗凝活性和酰胺酶活性确定蛋白C蛇毒激活作用。结果 :在 9种国产蛇毒中烙铁头蛇毒及蝮蛇毒在 1 5mg/L浓度下即使人血浆纯蛋白C产生酰胺酶活性 ,并使APTT显著延长。结论 :9种国产蛇毒中烙铁头蛇毒及蝮蛇毒具有激活人体血浆蛋白C成为活化蛋白C(APC)

中华眼镜蛇毒组分C抗白血病作用的实验研究

目的 :研究眼镜蛇毒组分C对白血病细胞的直接作用及机制。方法 :应用MTT、DNA电泳、流式细胞仪、RT_PCR等方法 ,观察眼镜蛇毒组分C对HL6 0等 9株白血病细胞系的毒性作用、量效关系及白血病细胞经过眼镜蛇毒组分C处理后的生物化学、Bcl - 2 /Bax表达水平变化。结果 :眼镜蛇毒组分对 9株人白血病细胞系均有明显的抑制作用 ,IC50 为 0 .0 0 4 6～ 4 .4 0 μg/ml,且呈较好的量效关系 (r为 0 .6 6～ 0 .99)。眼镜蛇毒组分C能诱导HL6 0细胞发生凋亡生物化学变化 ;流式细胞仪分析发现眼镜蛇毒组分C能使一定比例的J6_1、56 2、HL6 0细胞发生凋亡 ,而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加 ;RT_PCR方法检测发现眼镜蛇毒组分C能使HL6 0细胞Bcl_2基因的表达下调 ,而Bax变化不明显。结论 :眼镜蛇毒组分C对多种白血病细胞株均具有较强的抑制作用 ;此种抑制作用与剂量呈正相关。眼镜蛇毒组分C能诱导白血病细胞发生凋亡 ,此作用与Bcl_2基因的表达下调有关。

蛇毒蛋白C激活组份的作用机制研究

目的 研究蛇毒蛋白 C激活组份 F6.3 .2对蛋白 C的激活机制。方法 以 Ba Cl2 吸附血浆和纯化蛋白 C为作用底物 ,采用发色底物法测定蛇毒组份 F6.3 .2对蛋白 C的特异性激活作用 ,同时采用 SDS-PAGE测定该组份对蛋白 C的激活机制。结果 F6.3 .2没有直接作用发色底物使之生色的能力 ,它对 Ba Cl2 吸附血浆不表现生色反应能力 (与对照组相比 P>0 .0 5 ) ,而对纯化蛋白 C则表现出很强的生色反应能力 (与对照组 、对照组 相比 P<0 .0 1)。SDS-PAGE结果表明 ,F6.3 .2与纯化蛋白 C作用后的混合物 ,由两条链组成 ,一条链分子量为 19KDa,与纯化蛋白 C的轻链相同 ,另一条链分子量为 5 9.5 KDa,为纯化蛋白 C重链与 F6.3 .2的分子量之和 ,表明 F6.3 .2已结合到纯化蛋白 C的重链上。 结论 蛇毒蛋白 C激活组份 F6.3 .2对蛋白 C有特异性激活作用 ,它激活蛋白 C的可能机制是通过结合于蛋白 C的重链 ,形成 F6.3 .2 -蛋白 C复合物 ,引起蛋白 C变构 ,从而将蛋白 C激活为活化蛋白 C。

蛇毒蛋白C活化剂的研究进展

对蛇毒蛋白C活化剂的深入研究,使部分活化剂广泛应用干基础研究及临床诊断中,极大地促进了蛋白C基础理论及检测水平的进步。本文简要综述这方面的研究进展。

^(125)I标记眼镜蛇毒组分Ⅲ在小白鼠体内的分布和药代动力学研究

目的：探讨眼镜蛇毒（Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）蛇毒组分Ⅲ在小鼠体内的分布状况和在兔体内的药代动力学过程。方法：用氯胺－Ｔ法对眼镜蛇毒组分Ⅲ进行１２５Ｉ标记，用放射性核素示踪动力法检测血液中的药物浓度，以放射性参与量（脏器与血液放射比）的比值作为组分Ⅲ在组织中分布的依据。结果：小鼠尾静脉注射１２５Ｉ－组分Ⅲ后，２ｈ及 ４ ｈ放射性参与量大于 １的器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和肌肉，其中以肾脏分布最高，且 ４ ｈ放射性参与量高于２ｈ。兔静脉注射眼镜蛇毒组分Ⅲ７５、１５０和３００μｇ／ｋｇ三个剂量后，快分布相半衰期Ｔ１／２α为３９．６～４２．５ｍｉｎ，慢性分布相半衰期Ｔ１／２β为１６．８～１７．３ ｈｒ，消除相半衰期Ｔ１／２γ为２１．７～２２．１ｈｒ。结论：小鼠静注组分Ⅲ后２ｈ，以肾脏分布最高，肝脏与肺脏的放射性参与量也较高，尿中含量很高。兔静脉注射组分Ⅲ３个剂量后，血药－时间曲线经３Ｐ８７药动学程序拟合符合三房室模型特征，三个时相的半衰期各剂量组之间无显著性差异，ＡＵＣ与剂量成正比，表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程。

蛇毒纤维蛋白（原）溶解酶的研究进展

蛇毒纤溶酶能直接溶解纤维蛋白（原），具有作为强力溶栓剂的潜在价值。对蛇毒纤溶酶的深入研究，不仅有助于阐明蛇伤中毒患者的凝血病理机制，而且为其开发应用提供了理论基础。文章综述蛇毒纤溶酶的研究进展及应用前景，重点阐述其分子结构。