肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定

目的建立一种简单、快速有效的从细胞培养物中纯化肠道病毒71(EV71)的方法。方法 EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中增殖后,将获得的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、超速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定,并测定其感染性的滴度及回收率。结果 SDS-PAGE显示出3个条带,相对分子质量分别为3.6×103、3×103和2.6×103与EV71的VP1、VP2和VP3相符合。Westernblot证实为EV71特异性条带。经磷钨酸负染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒。采用终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82.0%,再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%。结论聚乙二醇6000沉淀结合氯化铯垫层超速离心的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便,易于操作,并且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度,是一种简便、有效的病毒纯化方法。

肠道病毒71型重组VP2蛋白原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP2蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71 VP2基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体形成pET32a(+)/VP2,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达产物,利用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经Western blot初步验证其抗原性。结果成功构建pET32a(+)/VP2重组质粒,经大肠杆菌表达,纯化获得相对分子质量约为48000的融合蛋白,经Western blot证实其抗原性良好。结论表达并鉴定了VP2抗原,为EV71疫苗研制及检测试剂盒的研发奠定了基础。

主动脉缩窄矫治术后血管结构与功能的随访研究

目的探讨主动脉缩窄矫治术后近、中期血管结构与功能改变。方法选取20例确诊主动脉缩窄（CoA）并行手术矫治的患儿（CoA组），其中单纯性主动脉缩窄6例，复合性主动脉缩窄（合并其他心内畸形）14例；同期20例单纯室间隔缺损（VSD）患儿（VSD组）作对照，均于术前至术后1年监测血压，超声下颈总动脉内中膜厚度（IMT）和肱动脉血流介导的血管舒张功能（FMD）。20例健康儿童（健康组）进行1年的随访。结果术前、术后1个月、术后6个月、术后1年3组均无高血压临床表现。CoA组的颈总动脉IMT[（0．47±0．10）mm、（0．49±0．10）mm、（0．57±0．07）mm、（0．61±0．07）mm]均高于同期的VSD组[（0．41±0．11）mm，（0．43±0．11）mm，（0．51±0．08）mm，（0．55±0．08）mm]与健康组[（0．40±0．09）mm、（0．42±0．11）mm、（0．50±0．08）mm、（0．57±0．08）mm]，差异均有统计学意义，P〈0．05。CoA组的肱动脉FMD[（5．46±1．51）％、（5．71±1．88）％、（5．42±1．69）％、（5．27±1．02）％]均明显低于VSD组[（6．69±1．45）％、（6．66±1．21）％、（6．81±1．03）％、（6．43±1．34）％]和健康组[（6．59±1．84）％，（6．84±1．41）％、（6．91±1．31）％、（6．56±1．62）％]，差异均有统计学意义，P〈0．05。而上述两个指标在VSD组与健康组之间均差异无统计学意义，P〉0．05。结论主动脉缩窄矫治术后患儿仍存在血管结构和内皮功能异常，提示手术纠治主动脉缩窄后血管损害持续存在，可能是主动脉缩窄矫治术后患儿心血管疾病发生率高于健康儿童的原因。