Nanog慢病毒载体构建及在胚胎干细胞分化调控中的应用

背景:在胚胎干细胞分化调控研究中,仍缺少安全有效的组织特异性启动子介导的荧光报告基因的慢病毒表达载体。目的:构建一个表达多能干细胞组织特异性启动子Nanog同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒表达载体Puro-Nanog-hr GFP,建立小鼠胚胎干细胞转基因细胞系,并观察其在小鼠胚胎干细胞细胞诱导分化过程中的表达。方法:利用PCR扩增Nanog基因,通过LR反应连接荧光报告基因hr GFP构建慢病毒表达载体Puro-Nanog-hr GFP。慢病毒包装并转导小鼠胚胎干细胞后运用嘌呤霉素筛选得到小鼠胚胎干细胞转基因细胞系并进行鉴定,然后诱导其分化,观察随着小鼠胚胎干细胞的分化Nanog的表达情况。结果与结论:通过特定引物PCR鉴定证实,慢病毒表达载体Nanog-hr GFP构建成功,将其成功导入小鼠胚胎干细胞,经筛纯化得到表达绿色荧光的小鼠胚胎干细胞单克隆细胞系,并通过诱导其分化可观察到绿色荧光表达逐渐减弱,可为进一步调控干细胞分化奠定基础。

Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用

背景:有研究报道胰酶消化在一定程度上会破坏精原干细胞表面抗原并影响细胞活性,对后续的细胞分选及下游实验有一定影响。Accutae酶具有蛋白酶和胶原酶的双重活性,在消化结束时无需终止和清洗,有保护细胞表面抗原的特殊作用,因而被应用于多种干细胞的培养及消化传代中。目的:比较Accutase酶和胰酶在原代消化分离睾丸组织获取精原干细胞中的作用。方法:新生5-7 d昆明雄鼠45只,取双侧睾丸胶原酶初步消化,混悬液定容后分为Accutase酶组、胰酶组、混合酶组(透明质酸酶+胰酶组),不同组别小鼠睾丸组织分别于酶消化1,3,5 min后显微镜下观察并拍照,比较各组不同时间点的消化状态及形成单细胞所需的时间;获取单细胞悬液后分别计算单位体积内所得细胞总数及死亡率;通过差速贴壁方法去除间质细胞及支持细胞,经包被有干细胞标志分子CD90.2的免疫磁珠进行分选,将所得CD90+及CD90-细胞用精原干细胞表面标志分子——胶质细胞源性神经营养因子受体α1标记,流式细胞仪检测不同组别CD90+及CD90-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1精原干细胞的阳性率。结果与结论:不同类别的消化酶对小鼠睾丸的消化作用有明显差异,其中Accutase酶能更快获取单细胞悬液,其细胞团及破膜细胞明显少于胰酶组和混合酶组,其所得细胞总数高于其余2组,而细胞死亡率则低于其余2组。差速贴壁后细胞免疫磁珠分选结果显示Accutase酶组CD90+精原干细胞得率高,流式分选结果显示胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90+细胞为72.24%,高于胰酶组及混合酶组(51.16%,71.27%);而胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90-细胞比率(15.03%)则低于胰酶组及混合酶组(18.8%,24.23%)。结果表明Accutase酶在分离和获取精原干细胞实验中效果优于胰酶。

ALC1介导的MAPK信号通路激活对肝癌细胞增殖的影响

目的探讨ALC1促肝癌细胞增殖作用与MAPK信号通路的关系。方法 qPCR检测肝癌细胞系ALC1 mRNA表达;MTS实验及平板克隆实验验证ALC1 siRNA干扰后对Huh7细胞增殖能力的影响;Western blot法从蛋白水平检测验证ALC1 siRNA干扰后MEK/ERK通路相关蛋白的磷酸化改变。结果肝癌细胞株Huh7、HepG2及BEL-7402均有ALC1 mRNA表达,其中Huh7细胞ALC1 mRNA表达水平明显高于其它细胞株。MTS实验结果显示ALC1 siRNA干扰后Huh7细胞增殖速度与对照组相比明显下降(P<0.05);平板克隆实验结果显示siRNA干扰ALC1表达后Huh7细胞克隆体积变小,克隆形成数量与对照组相比明显减少,差异有显著性(P<0.05)Western blot实验结果显示与对照组相比ALC1siRNA干扰可明显降低Huh7细胞MEK、ERK蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。结论 ALC1高表达于肝癌Huh7细胞;ALC1介导了MAPK信号通路激活对Huh7细胞增殖能力的影响。

应用声触诊量化技术诊断小鼠肝纤维化

目的:声触诊量化技术(virtual touch tissues quantifleation,VTQ)在小鼠肝纤维化诊断中的实验研究.方法:40只小鼠随机分成对照组、CCl4 1 wk组、CCl4 4 wk组和CCl4 8 wk组.于造模时间点测定VTQ测量值(Vs值);检测门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、Ⅳ型胶原(Ⅳcollagen,Ⅳ-C)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)和层黏连蛋白(laminin,LN)的变化;制作肝组织石蜡切片,观察病理学变化.结果:HE染色显示对照组肝小叶结构正常;1wk时可见肝细胞少量坏死,炎症细胞少量浸润;4 wk时肝细胞气球样变明显,可见不同程度碎屑坏死;8 wk时正常肝小叶结构消失,大量炎症细胞浸润.Masson染色显示对照组仅在中央静脉壁上少量绿色胶原纤维;1 wk时中央静脉及汇管区可见绿色胶原纤维;4 wk时胶原纤维间隔较明显;8 wk时大量增生的胶原纤维包绕、分割成大小不等的假小叶.血清学AST、AST、Ⅳ-C、LN及HA检测比较:1 wk组与对照组无差别(P>0.05),4 wk组、8wk组与对照组差别具有显著性意义(P<0.01,P<0.001).VTQ测量值(VTQ value,Vs)显示1wk组与对照组无差别(P>0.05);4、8 wk组与对照组差别具有显著性意义(P<0.001).结论:与组织病理学及血清学检测一样,声触诊量化技术也可作为一种新手段在诊断肝纤维化动态变化中提供一定的参考价值.

肿瘤相关巨噬细胞对肝癌EZH2表达的影响

目的研究肝癌微环境中肿瘤相关巨噬细胞对转录因子EZH2表达的影响及意义。方法用佛波豆寇乙酸(PMA)诱导人单核细胞系THP-1细胞分化为M2型巨噬细胞;用M2型巨噬细胞与肝癌BEL-7402 or QGY-7703细胞共培养方法模拟肝癌免疫微环境,未共培养的肝癌BEL-7402或QGY-7703细胞为空白对照,q RT-PCR和Western blot分别从m RNA和蛋白质水平检测两组肝癌细胞EZH2的表达水平;免疫组织化学检测肿瘤相关巨噬细胞标记分子CD163与EZH2的表达并进行相关性分析。结果 q RT-PCR及细胞形态学显示巨噬细胞诱导成功;巨噬细胞与肝癌细胞QGY-7703、BEL-7402共培养后,EZH2的表达明显下调,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);肝癌组织芯片免疫组织化学显示肝癌癌巢组织中CD163+巨噬细胞数量明显少于癌旁组织(P<0.05),癌巢组织中巨噬细胞CD163表达分值与肝癌细胞EZH2表达分值呈负相关(r=-0.32,P=0.018)。结论巨噬细胞与肝癌细胞共培养可下调肝癌细胞EZH2的表达;肝癌癌巢组织中巨噬细胞CD163表达分值与肝癌细胞EZH2表达分值呈负相关。

肝硬化部分切除后肝再生及结构变化

背景:肝脏自身具有强大的再生能力,临床资料显示大部分肝癌患者合并有肝硬化,切除肿瘤后肝脏质量可逐渐恢复,提示硬化的肝脏仍具备修复潜能。目的:尝试用肝部分切除方法诱导小鼠硬化肝组织内具再生能力的细胞增殖,观察再生肝脏的结构变化。方法:使用CCl4皮下注射方法制备小鼠肝硬化模型。对肝硬化小鼠行肝部分切除,于切除后1,3,5,7,10,14及21 d取小鼠肝组织并称质量。观察比较肝部分切除后不同时间小鼠再生肝组织的结构变化;评估肝再生率;免疫组化方法分析肝星形细胞标志分子结蛋白及肝星形细胞活化标志分子α-平滑肌肌动蛋白的表达变化;5-溴脱氧尿核苷标记技术对增殖细胞进行定性、定位。结果与结论:肝硬化小鼠肝部分切除后第1,3,5,7,14,21天肝再生率分别为6.58%,22.03%,21.39%,29.05%,45.22%,50.98%。苏木精-伊红染色和Masson染色显示CCl4注射8周后呈早期肝硬化病理改变,肝部分切除后肝组织结构逐步改善。免疫组化结果显示肝部分切除后第1天再生肝组织内结蛋白表达减少,但第3天至第14天呈上升趋势,21 d则明显减少;肝再生过程中各时间点α-平滑肌肌动蛋白表达依时递减。5-溴脱氧尿核苷阳性细胞在肝部分切除后1-7 d主要为肝细胞,肝部分切除后14-21 d阳性细胞定位于肝血窦内皮及窦腔内。结果表明早期肝硬化小鼠大部肝切除后3 d出现明显的再生反应,并逐步恢复正常的肝组织结构。

ALC1/CHD1L与OV6在肝癌细胞中的共存及其对干性相关转录因子表达的影响

目的探讨ALC1/CHD1L与OV6阳性肝癌细胞的关系及其对干性相关转录因子表达的影响。方法细胞免疫荧光标记方法观察肝癌Huh7及Hep G2细胞中ALC1/CHD1L和OV6的表达及定位;q RT-PCR检测ALC1/CHD1L sh RNA干扰后对肝癌Huh7及Hep G2细胞干性相关分子Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin表达的影响。结果细胞免疫荧光标记结果显示肝癌Huh7细胞和Hep G2细胞中均有ALC1/CHD1L与OV6的表达,两者共表达率为34.3%及48.34%;ALC1/CHD1L sh RNA干扰及q RT-PCR实验结果显示敲减Huh7及Hep G2细胞ALC1/CHD1L表达可引起Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin等干性相关分子表达下降,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论肝癌Huh7及Hep G2 OV6阳性细胞中有ALC1/CHD1L表达;敲减ALC1/CHD1L表达可引起Huh7及Hep G2细胞干性相关分子Oct4、Sox2、Nanog、Bmi1、β-catenin表达明显下调。

运用雨课堂在机能实验学中实施高效精准互动混合式教学

目的:课前督促学生预习,精准掌握预习情况和指导学生预习;课中高效精确掌握学生的学习情况,实施高效精准互动教学;课后高效精确分析教学效果,为下一步教学设计提供客观依据。方法:在机能实验教学中,运用雨课堂构建了"课前—课堂—课后"高效、精准、互动、混合式教学模式,然后对学生进行问卷调查。结果:89. 5%的学生认为雨课堂能高效分享资料,89. 4%的学生认为便于自主学习,84. 2%的学生喜欢这种教学模式,84. 2%的学生认为雨课堂能高效互动、精准反馈,86%的学生认为雨课堂能精准检测学习效果。结论:学生非常喜欢雨课堂支持的教学模式,这有效促进了师生互动,精准掌握学情,提高了教学效率,改善了教学效果。