低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞环状RNA筛选

目的探讨环状RNA在人胎盘绒毛膜间充质干细胞低氧预处理和常氧培养中表达谱的差异。方法利用芯片技术检测3例低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞及其相应对照的常氧培养细胞的环状RNA表达,分析两者差异表达的环状RNA及其结合mi RNA。结果在检测的13 617条环状RNA中,有分析结果的环状RNA12 114条,低氧和常氧培养人胎盘间充质干细胞差异表达环状RNA共102条,其中低氧中表达上调的85条,下调的17条(倍数变化>1.5倍且P<0.05),而表达差异倍数变化大于2倍以上的环状RNA有27条,且均为上调表达。每个环状RNA预测到5个结合mi RNA。结论低氧预处理使得人胎盘绒毛膜间充质干细胞的环状RNA表达谱发生了显著变化,这些环状RNA可能和低氧预处理有关。

染色体微阵列分析技术在核型正常的骨骼系统发育异常患儿中的应用研究

目的探讨染色体微阵列分析技术（chromosome microarray analysis，CMA）在核型正常的骨骼系统发育异常（skeletal anomalies，SA）患儿中的应用价值。方法选取2012年6月至2015年5月因骨骼系统发育异常伴或不伴有其他异常而到广州市妇女儿童医疗中心就诊的43例患儿。所有患儿均行常规G显带染色体核型分析，核型结果正常者按照美国Affymetrix公司CytoScan750K芯片的标准操作流程进一步行全基因组CMA检测，并通过配套的CHAS软件及相关的生物信息学方法分析检测结果。结果43例患儿中，染色体核型分析发现2例患儿染色体核型异常，核型异常比例为4．65％。41例核型结果正常的患儿进一步行全基因组CMA检测。在CMA检测的患儿中，分为单纯SA组17例，SA合并精神运动发育迟缓组6例，SA合并其他系统结构畸形组18例。CMA检测结果提示9例患儿基因组发生了致病性拷贝数变异（copy number variations，CNVs），致病性CNVs的总体检出率为21．95％。其中，单纯SA组、SA合并精神发育迟缓组以及SA合并其他系统结构畸形组的致病性CNVs检出率分别为17．65％（3／17）、33．33％（e／6）以及22．22％（4／18）[P=0．576（17．65％vs．33．33％）、P=1．000（17．65％VS．22．22％）和P=0．618（33．33％vs．22．22％），Fisher’s检验]。结论全基因组高分辨率CMA技术在核型正常的骨骼系统发育异常患儿中能够将致病性检出率额外提高了21．95％，建议染色体核型结果正常的骨骼系统发育异常患者进一步行CMA检测。单纯SA组、SA合并精神运动发育迟缓组以及SA合并其他结构畸形组之间其致病性CNVs检出率没有统计学差异。

染色体微阵列分析技术在室间隔缺损胎儿中的应用研究

目的应用染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）探讨胎儿室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）的病因。方法选取248例产前超声提示为VSD伴或不伴其他结构畸形的胎儿，将其分为单纯VSD组、VSD合并其他心内异常组、VSD合并心外异常组（包括其他畸形和超声软指标异常）以及VSD合并心内外异常组。对所有胎儿进行常规染色体分析，对6例核型为异常者以及部分核型为正常者进一步进行CMA检测，随访所有胎儿的妊娠结局，对新生儿随访至1岁。结果在248例胎儿中，共发现60例核型异常（包括50例数目异常、7例结构异常、3例嵌合体），检出率为24．2％。CMA检测明确了6例核型异常者衍生染色体的来源和性质，其中2例的缺失区段包含Wolf-Hirschhorn综合征的关键区域，其中包含的WHSCl、LBXl、LDB3、BBS10等可能是先天性心脏病的候选致病基因。在143例核型正常的胎儿中，CMA在11例中发现了致病性拷贝数变异（copy number variants，CNVs），检出率为7．70A（11／143），其长度介于0．33～4．53Mb，其中9例为已知的微缺失或微重复综合征，包括22qli．2微缺失综合征、17p11．2微缺失综合征（Smith-Magenis综合征）、17p13．3微缺失综合征（Miller-Dieker综合征）、1p36微缺失综合征、lq21．1微重复综合征和4q缺失综合征。其致病性CNVs所包含的可能与VSD相关的致病基因包括TBX1、LZTR1、FAT1、AKAP10、SKI、PRDM26、GJA5、ERCC4以及YWHAE。在CMA结果正常的新生儿中，48．4％的VSD在出生后1年内自然闭合。结论CMA技术可将胎儿VSD的遗传学病因检出率提高7．7％，但不同组别的VSD胎儿之间致病性CNVs的检出率无明显差异。对于染色体核型正常的VSD胎儿，建议进一步行CMA分析。

清远地区MTHFR基因多态性与原因不明复发性流产的相关性研究

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点单核苷酸多态性与原因不明复发性流产(URSA)的发生之间的相关性。方法采用前瞻性病例对照研究,选取清远地区71例URSA患者与76例两次正常生育妇女作为对照,采用实时定量PCR分析技术检测MTHFR基因C677T位点单核苷酸多态性情况,并用χ^2检验分析URSA组与对照之间的C677T位点基因型的差异。结果 URSA组MTHFR(C677T)基因纯合突变型TT及等位基因T的频率均高于正常对照组。结论清远地区不明原因复发性流产的发生与MTHFR基因C677T位点纯合突变型TT存在相关性。

染色体微阵列分析技术在马蹄足内翻胎儿产前诊断中的应用

目的：探讨染色体微阵列分析技术（CMA）在马蹄足内翻（TE）胎儿产前诊断中的应用。方法选取2012年5月至2015年6月经产前超声检查提示为TE、伴或不伴有其他结构畸形并行侵入性产前诊断的54例胎儿，根据是否合并其他结构异常分成单纯TE组及复杂TE组。所有胎儿均行常规染色体核型分析，核型正常者再进一步行全基因组高分辨率CMA检测，并应用CHAS软件及相关的生物信息学方法分析CMA检测结果。对所有胎儿进行随访，了解妊娠结局及产后诊治情况。结果54例TE胎儿中，常规染色体核型分析发现1例核型异常，为18三体，核型异常比例为2%（1/54）。核型正常的53例胎儿中单纯TE组38例、复杂TE组15例，进一步行CMA检测，致病性拷贝数变异（CNV）检出率为11%（6/53），单纯TE组和复杂TE组的致病性CNV检出率分别为5%（2/38）及4/15，两组比较，差异有统计学意义（P=0.047）。对53例胎儿进行随访，51例随访成功，其中11例出生时无足内翻表现，产前超声诊断为TE的假阳性率为22%（11/51）。结论常规染色体核型分析技术对TE伴或不伴其他结构畸形的胎儿的异常核型检出率为2%，CMA技术对核型正常的TE胎儿的致病性CNV的检出率提高至11%。结合产前超声诊断TE的假阳性率及两组致病性CNV的检出率，建议核型正常的TE合并其他畸形的胎儿进一步行全基因组高分辨率CMA检测，以排除染色体微缺失或微重复的可能性；单纯TE胎儿建议行连续超声复查，如复查结果仍提示为TE，则建议行CMA检测，以降低侵入性产前诊断率及假阳性率。

染色体微阵列技术在分析胎儿侧脑室扩张病因方面的应用

目的探讨全基因组高分辨染色体微阵列分析（chromosome microarrayanalysis，CMA）技术在产前超声或磁共振提示侧脑室扩张（ventriculomegaly，VM）且染色体核型为正常的胎儿中的应用价值。方法收集2011年7月至2016年6月在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心就诊的341例产前超声或磁共振提示胎儿为VM的孕妇病例，按VM的程度、是否合并其他异常、VM为单侧还是双侧以及孕妇是否高龄等因素进行多维度分组。对所有胎儿样本进行染色体核型分析，对染色体核型正常的胎儿样本进行CMA分析，并对全部病例进行临床随访，了解妊娠结局和新生儿预后。结果（1）341例胎儿样本中，21例为染色体核型异常，异常核型发生率为6．2％（21／341）。320例染色体核型正常，其中有179例（55．9％，179／320）胎儿样本进一步接受全基因组高分辨CMA检测，结果提示12例（6．7％，12／179）胎儿存在致病性拷贝数变异（copynumbervariations，CNVs）。致病性CNVs大小范围在198kb～8．71Mb之间，分别为1q21．3q23．1微缺失、2q37．3微缺失、3p14．1p13微缺失、6q25．3微缺失、8q11．23微重复、10q21．1微缺失、15q11．2微缺失、16p13．11p12．3微重复、22q13．33微重复、22q11．21微重复（22q11微重复综合征）以及Xp21．1微缺失（Duchenne型肌营养不良症）。（2）将VM胎儿的致病性CNVs检出率进行分组比较，轻度VM组和重度VM组分别为7．5％73S．3．1％（P=0．615）；孤立性VM组和非孤立性VM组分别为6．1％vs.7．4％（P=0．732）；单侧VM组和双侧VM组致病性CNVs检出率分别为5．6％vs.7．9％（P=0．511）；高龄组和非高龄组分别为6．7％vs．6．7％（P=1．000）。结论VM胎儿中染色体核型异常检出率为6．2％。在染色体核型正常的VM胎儿中，CMA能额外提高6．7％的致病性检出率，且不同组别的VM与致病性CNVs之间的相关性无统计学意义。对于VM的胎儿建议进一步行CMA分析。

介入性产前诊断术后妊娠结局分析

目的：总结广州市妇女儿童医疗中心（简称本中心）介入性产前诊断术后的流产情况。方法对2011年1月1日至2012年6月1日行介入性产前诊断、术后成功随访，并明确术后发生流产或妊娠终止的病例进行回顾性分析。采用t检验和χ2检验进行统计学处理。结果共4322例纳入研究，其中羊膜腔穿刺3275例（75.7%），脐血穿刺534例（12.3%），绒毛活检513例（11.9%），接受产前诊断的临床指征主要包括唐氏综合征高风险、胎儿超声异常、孕妇及配偶轻型地中海贫血及孕妇高龄等；16例发生流产或妊娠终止，发生率为0.37%；孕妇中位年龄33岁（24～44岁），中位孕周21周（13～38周）；其余4306例接受介入性产前诊断孕妇的中位年龄30岁（19～44岁），中位孕周19周（11～36周）。发生与未发生流产孕妇的年龄（t=0.76，P=0.59）及行穿刺时的孕周差异无统计学意义（t=0.41，P=0.81）。发生流产的中位时间为6 d（0～24 d），晚期先兆流产和妊娠终止各8例。16例流产病例中，12例染色体核型正常，3例发现染色体异常，1例诊断为重度α-地中海贫血。在12例染色体核型正常的病例中，6例胎儿发现胎儿淋巴水囊瘤或腹裂等明显的超声结构异常。行羊膜腔穿刺、绒毛活检和脐血穿刺的流产率分别为0.37%（12/3275）、0.19%（1/513）和0.56%（3/534），3种穿刺方法的流产率差异无统计学意义（χ2=0.96，P=0.62）。结论本中心介入性产前诊断流产率较低。严格掌握产前诊断指征是降低介入性产前诊断流产风险的重要保证。

稳定沉默动粒蛋白-H表达的人乳腺癌细胞株的构建

目的 构建人动粒蛋白-H（CENP-H） shRNA反转录病毒表达载体,获得稳定转染的人乳腺癌细胞株.方法 合成CENP-H基因干扰序列,定向插入反转录病毒表达载体pSUPE-Rretro-puro质粒并测序鉴定;干扰质粒经磷酸钙介导转染293FT细胞制备反转录病毒;对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435细胞进行反转录病毒感染,嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株.Real-time PCR和Western blot分别检测稳定转染细胞株的CENP-H mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建和筛选出靶向CENP-H基因的两对shRNA质粒表达载体.稳定转染细胞CENP-H mRNA表达显著下调,CENP-H的蛋白表达水平明显低于对照.结论 稳定沉默CENP-H表达的人乳腺癌细胞株的建立,为以CENP-H基因为靶点的人乳腺癌基因研究提供了实验基础.

染色体微阵列分析在815例早孕期颈项透明层增厚胎儿中的应用

目的:探讨颈项透明层(nuchal translucency,NT)增厚胎儿的遗传学病因及预后。方法:收集产前超声提示NT增厚(≥3.0 mm)的胎儿815例,根据NT的厚度将其分为3.0~3.4 mm组、3.5~4.4 mm组、4.5~5.4 mm组、5.5~6.4 mm组以及≥6.5 mm组,又根据是否合并其他结构异常分为单纯NT增厚组和合并其他结构异常组。应用染色体微阵列(chromosomal microarray analysis,CMA)对其进行分析,并追踪妊娠的结局。结果:CMA检测共发现178例胎儿携带致病性CNVs,总体检出率为21.8%。其中染色体数目异常138例,占77.5%;微缺失/微重复综合征14例,占7.9%;其余26例(14.6%)携带非综合征性致病性CNVs。614例成功随访,排除CMA检测阳性以及结构异常后,不良妊娠结局者仅占2.7%。不同NT厚度组胎儿致病性CNVs检出率的差异具有统计学意义(χ^2=107.329,P=0.000);合并与未合并其他结构异常组致病性CNVs检出率的差异有统计学意义(χ^2=7.722,P=0.005);不同NT厚度组总体不良妊娠结局发生率之间的差异有统计学意义(χ^2=109.146,P=0.000)。结论:CMA可作为一线检测技术应用于早孕期NT增厚的胎儿,致病性CNVs的总体检出率高达21.8%,可为产前遗传咨询提供依据。NT厚度与合并超声结构异常、致病性CNVs以及胎儿不良妊娠结局相关,尤以NT≥4.5 mm者为甚。胎儿NT增厚合并其他结构异常时不良妊娠结局的风险增加。

全基因组高分辨率染色体微阵列分析在超声结构异常胎儿中的应用

目的探讨全基因组高分辨率染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）技术在先天性结构异常胎儿中的应用价值。方法应用美国Affymetrix公司全基因组高分辨率CytoScanHD芯片对651例孕期超声检查提示先天性结构发育异常，但常规染色体核型分析未见异常的胎儿病例进行基因组学研究。包括发生单一畸形者264例，多发畸形者387例。其中产前绒毛样本130例，羊水样本192例，脐血样本329例。全部胎儿样本DNA的提取及CMA实验操作流程均按照生产商提供的标准流程操作。CMA分析所发现的拷贝数变异（copy number variants，CNVs）都进一步通过荧光原位杂交或实时荧光定量PCR反应进行验证。结果CMA分析发现475例（73％）胎儿的基因组发生拷贝数变异；其中75例（11．5％）胎儿发现与临床疾病相关的致病性CNVs，包括2例单亲二倍体和2例隐匿性的嵌合体；另外13例（2．0％）胎儿病例中发现临床意义不明确的拷贝数变异。结论全基因组高分辨率CMA在超声结构异常胎儿的遗传学分析中具有重要的应用价值，能够将检出率提高11．5％左右。应用单核苷酸多态性芯片对单亲二倍体和低水平的嵌合体均具有独特的检出能力。实验操作人员和遗传咨询医生之间的充分交流，结合家系分析以及内外数据库之间的比对能够显著降低临床意义不明确的CNVs。