华南地区非小细胞肺癌患者肿瘤组织EGFR,ALK和ROS1基因突变分析

目的探讨华南地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织表皮生长因子受体(EGFR),变性淋巴瘤激酶(ALK)和C-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)基因突变特点及其与临床特征的关系。方法收集2016年11月～2017年6月间华南地区76例NSCLC患者肿瘤组织及相应临床资料,利用ARMS法三基因突变联合检测试剂盒检测各肿瘤组织的EGFR,ALK,ROS1基因突变状态,并做各基因突变率与临床特征的相关性分析。结果在华南地区76例NSCLC患者中,EGFR基因突变率为55.3%(42/76),19 del和L858R突变为其主要突变类型,检出1例19del联合L858R共突变;ALK基因融合阳性率为17.1%(13/76),检出4例ALK基因融合联合EGFR基因突变;ROS1基因融合的阳性率为1.3%(1/76),未见ROS1基因联合EGFR基因或ALK基因共突变。与ROS1基因相比,EGFR和ALK基因突变率更高,差异具有统计学意义(χ~2=54.515,P=0.000;χ~2=11.329,P=0.001)。非吸烟NSCLC患者EGFR基因突变率高于吸烟患者,差异具有统计学意义(χ~2=4.578,P=0.032),而ALK与ROS1基因突变率的差异则不具有统计学意义(χ~2=0.000,均P值>0.05);不同年龄、性别和组织学分型的NSCLC患者其EGFR,ALK与ROS1基因突变率的差异不具有统计学意义(χ~2=0.000～2.219,均P值>0.05)。结论 EGFR,ALK和ROS1基因突变均可见于华南地区NSCLC患者,其中以EGFR和ALK基因突变率更高。

乳腺良恶性肿瘤组织中CD44的表达及其与淋巴管生成的关系

目的研究细胞黏附分子44(CD44)在乳腺良恶性肿瘤组织中的表达及其与淋巴管生成的关系,探讨其在鉴别诊断中的应用价值。方法收集2005~2015年广州医科大学附属肿瘤医院乳腺肿瘤患者组织样品75例(均为女性)并分为良性肿瘤组、乳腺浸润性导管癌淋巴结转移组和未转移组,每组各25例。免疫组织化学法(IHC)检测CD44在各组患者肿瘤组织样品中的表达并以CD44作为淋巴管内皮细胞标记物比较各组样品中的淋巴管生成情况。生物信息分析验证研究结果。结果在良性肿瘤组、乳腺浸润性导管癌淋巴结转移组和未转移组中,CD44的IHC评分结果分别为0.60±0.82,3.16±2.70和3.52±2.47,乳腺浸润性导管癌淋巴结转移组和未转移组的CD44表达水平均高于乳腺良性肿瘤组,差异具有统计学意义(F=13.52,P<0.000 1)。以CD44作为淋巴管内皮细胞特异性标记物可有效辅助三组样品的淋巴管生成计数。在乳腺良性肿瘤组、乳腺浸润性导管癌伴淋巴结转移组和未伴淋巴结转移组中,淋巴管生成数分别为4.08±2.43,13.80±13.54和12.72±13.69,乳腺浸润性导管癌淋巴结转移组和未转移组的淋巴管生成数均高于乳腺良性肿瘤组,差异具有统计学意义(F=4.94,P=0.009 7)。生物信息分析结果也显示CD44在乳腺癌中的表达较正常乳腺增加。结论乳腺癌的发生与CD44表达以及淋巴管的生成有关。CD44有望成为乳腺良性肿瘤与乳腺癌的辅助鉴别诊断指标,同时其也可作为乳腺淋巴管内皮细胞的特异性标记物。

D-CIK治疗降低外周血EMT相关分子表达的初步研究

目的 探讨D-CIK治疗结肠癌后,患者外周血中EMT相关分子的变化情况及意义.方法 本研究纳入34例明确诊断为结肠癌患者,接受D-CIK细胞回输治疗,观察检测治疗前后患者外周血中EMT相关分子变化情况及治疗过程中相关不良反应.结果 患者接受D-CIK治疗后,循环血中EMT相关分子出现了明显的变化,和治疗前对比,Twist和Vimentin的表达水平明显下降（P＜0.05）.治疗过程中未见严重的不良反应.结论 D-CIK治疗安全可靠,可以减少患者外周血中EMT相关分子的表达.

放射性口腔黏膜炎早期使用羟考酮控释片与解热镇痛药止痛治疗的对照研究

目的对比放射性黏膜炎轻度疼痛患者使用羟考酮控释片与世界卫生组织(WHO)三阶梯止痛方案的止痛效果与不良反应。方法收集放射性黏膜炎轻度疼痛患者40例的资料,随机分为观察组(羟考酮组)和对照组(三阶梯组)。在患者出现放射性黏膜炎轻度疼痛时,分别采用羟考酮控释片和解热镇痛类药物止痛治疗。对比两组间止痛效果、不良反应、营养状态的差异。结果观察组和对照组各20例患者入组。对照组和观察组疼痛评分≤3分的时间分别为(19.90±6.53)d和(21.73±6.91)d,差异无统计学意义(P=0.295)。两组患者体重均明显下降,两组间比较差异无统计学意义[(7.34±3.71)%vs(6.98±4.58)%,P=0.344]。两组的止痛药相关不良反应均不严重,观察组多于对照组。结论对于放射性口腔黏膜炎轻度疼痛患者,羟考酮止痛效果略优,差异无统计学意义,不良反应多于解热镇痛类药物,需要更好地对症处理。

广东地区997例大肠癌临床特征

目的探究广东地区近10年大肠癌临床流行特征。方法分析2005年6月至2013年9月广州医科大学附属肿瘤医院997例首诊新发大肠癌手术患者临床流行病资料。结果 997例大肠癌中位年龄58岁,男性和女性组年龄差异无统计学意义（P〉0.05）。男∶女为1.49∶1。直肠癌占49.7%,左半结肠癌占30.6%,右半结肠癌占19.7%。男女性别组中直肠癌例数高于结肠癌。997例大肠癌组织学类型腺癌占98.2%,印戒细胞癌占1.6%,腺癌中中分化腺癌占76.6%。991例明确病理分期的患者中0-ⅡC期占48.9%。结论广东地区大肠癌患者近10年病变部位以直肠为主,组织学类型以腺癌为主,早期就诊率较高。

肠和煎液治疗急性放射性肠炎临床观察

目的:观察肠和煎液对急性放射性肠炎的治疗作用及其机制。方法:将62例急性放射性肠炎患者,随机分为观察组和对照组。2组均予放射治疗,观察组32例予口服肠和煎液治疗,对照组30例予口服诺氟沙星和蒙脱石散治疗。观察2组患者治疗前后肠炎症状,血浆超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)变化。结果:总有效率观察组93.75%,对照组76.67%,2组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。治疗后观察组各症状评分均显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),观察组血浆SOD及GSH-Px水平显著高于对照组(P<0.05)。结论:肠和煎液治疗急性放射性肠炎疗效确切,其作用机制可能与体内抗氧化防御系统有关。

人CDK14基因表达荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种人细胞周期蛋白依赖性激酶14(CDK14)基因表达荧光定量PCR检测方法。方法利用Trizol法提取不同人肺癌细胞株中总RNA,以β-Actin和CDK14分别为内参和目的基因,分别设计特异性扩增引物,建立人CDK14基因表达荧光定量PCR检测系统并评估其检测性能。同时将其应用于不同细胞系siRNA干扰前后的CDK14基因相对表达水平检测。结果经电泳分析、熔解曲线、产物测序确认人CDK14基因表达荧光定量PCR检测系统已建立,其特异性良好,重复性佳(CV=7.13%),线性范围较宽(CDK14与β-Actin分别在Ct值范围22.47~32.96与15.14~27,55间具有良好的相关性,r^2=0.9844。)。利用该体系检测发现:在HCC827 D5和H1650细胞中CDK14基因高表达;在1~3号干扰片段中,1号片段为有效片段。结论人CDK14基因表达荧光定量PCR检测方法已成功建立。

EGFR基因T790M突变COLD-PCR扩增体系的Tc值筛选

目的筛选表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变PCR扩增体系的Tc值并初步建立具T790M突变富集效果的低变性温度下的复合聚合酶链反应(COLD-PCR)体系,同时探讨Tc值的筛选策略以及注意事项。方法以肺癌MSTO-211H、NCI-H1975细胞为T790M突变野生型和突变型标准样品,通过目标片段关键变性温度筛选实验、COLD-PCR反应模式比较实验以及Tc值的验证实验,确定COLD-PCR体系的Tc值并初步验证其效果。结果本实验体系T790M突变的目的扩增片段关键变性温度低于野生型片段,据此体系反应模式选择为快速COLD-PCR反应模式,同时确定Tc值为89.6℃,验证实验显示本体系可检出1%的T790M突变,较常规PCR提高5倍。至此T790M突变富集COLD-PCR扩增体系已成功建立。结论成功完成体系Tc值的筛选并建立T790M突变富集COLD-PCR扩增体系。

KRAS基因突变直接测序检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床的KRAS基因直接测序突变检测方法.方法 以KRAS基因12、13密码子为突变检测靶位点设计特异性扩增、测序引物,以已知12、13密码子野生型、突变型样品分别做为阴、阳性对照品,建立KRAS基因突变直接测序检测方法,并行方法学评估.结果 成功建立了KRAS基因突变直接测序检测方法,该方法检测灵敏度达3.9 ng/μl,重复性良好.检测17例结直肠癌样品,突变率为23.5％.结论 本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因突变直接测序检测方法.

EGFR基因突变直接测序检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床表皮生长因子受体（EGFR）基因直接测序突变检测方法.方法 以EGFR基因突变热点19、21外显子为突变检测靶位点设计特异性扩增、测序引物,以已知19、21外显子野生型、突变型样品分别做为阴、阳性对照品,建立EGFR基因突变直接测序检测方法,进行方法学评估.结果 成功建立了EGFR基因突变直接测序检测方法,该方法检测灵敏度为4.7 ng/μl,重复性良好.检测30例结非小细胞肺癌样品,突变率为26.7％.结论 本研究建立了可用于临床样品检测的EGFR基因突变直接测序检测方法.

miR-17-5p靶向PTEN促进非小细胞肺癌吉非替尼耐药

目的探讨miR-17-5p在NSCLC吉非替尼耐药中的作用。方法 QRT-PCR法检测miR-17-5p在细胞模型中的表达。MTS法检测细胞过表达或敲低miR-17-5p后的耐药性变化。预测miR-17-5p下游靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验、功能阻断实验等证实miR-17-5p通过靶向PTEN基因介导对吉非替尼的耐药。QRT-PCR法检测耐药前后NSCLC患者血清中的miR-17-5p表达。结果 miR-17-5p在耐药细胞中表达增加(P <0.05)。敏感与耐药细胞中分别过表达和敲低miR-17-5p后,细胞对吉非替尼耐药性分别增加和降低(P <0.05)。发现PTEN为miR-17-5p下游靶基因,敲低PTEN后可逆转敲低miR-17-5p导致的耐药性降低。耐药后NSCLC患者血清中miR-17-5p表达升高。结论 miR-17-5p通过下调PTEN表达促进了NSCLC对吉非替尼的耐药。

Wnt信号通路转录上调EGFR促进非小细胞肺癌吉非替尼耐药

目的探讨Wnt信号通路和表皮生长因子受体(EGFR)在非小细胞肺癌(NSCLC)吉非替尼耐药中的作用及其机制。方法运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和免疫印迹实验(Western blot)检测EGFR在亲代HCC827细胞与吉非替尼耐药细胞(HCC827/R)中的表达;免疫组化染色检测耐药前后3对NSCLC肿瘤组织中EGFR的表达。双荧光素酶报告基因实验(Luciferase)检测亲代HCC827细胞与耐药HCC827/R细胞Wnt信号通路活化情况;在Jaspar数据库中预测EGFR基因启动子区上TCF/LEF转录因子结合位点;染色质免疫共沉淀实验(Chip)和Luciferase实验检测转录因子对基因表达的调控;功能阻断实验检测Wnt信号通路/EGFR途径介导吉非替尼耐药的作用。结果与亲代HCC827细胞相比较,HCC827/R细胞的EGFR在mRNA和蛋白水平表达均明显增高(P<0.05)。免疫组化染色结果显示在3例吉非替尼耐药前后NSCLC配对肿瘤组织样品中有2例耐药后EGFR表达较耐药前增加。Luciferase实验结果显示,与亲代细胞比较,Wnt/β-catenin信号通路在耐药HCC827/R细胞中异常活化(P<0.05)。生物信息学分析预测到EGFR基因启动子区-1476^-1468区域存在Wnt/β-catenin信号通路下游转录因子TCF3/TCF4结合位点,Chip和Luciferase实验证实Wnt/β-catenin信号通路可转录上调EGFR表达。功能阻断实验结果显示当利用Wnt3a刺激亲代HCC827细胞的同时敲低EGFR,吉非替尼对细胞的抑制率较单独利用Wnt3a刺激细胞时的细胞抑制率得到恢复(P<0.05)。结论 Wnt/β-catenin信号通路转录上调EGFR促进NSCLC的吉非替尼耐药,其为提高NSCLC吉非替尼靶向治疗效果提供了新的实验依据。

非小细胞肺癌细胞株HCC827克隆异质性及其与吉非替尼敏感性的关系

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株HCC827的克隆异质性,分析其与吉非替尼敏感性的关系。方法取对数生长期HCC827细胞,利用极限稀释法获得单克隆化HCC827子代细胞株,分为A、B、C、D、E、F组;另取对数生长期HCC827细胞,记为亲代细胞组。采用平板克隆形成实验观察各组细胞平板克隆形成数,采用细胞生长曲线实验观察各组细胞增殖倍数,观察细胞增殖能力异质性;采用细胞药敏实验观察各组细胞对吉非替尼敏感异质性;采用Sanger直接测序法检测各组细胞EGFR基因,采用荧光原位杂交实验检测各组细胞MET、HER2基因,观察各组细胞遗传异质性;采用细胞克隆混合实验观察吉非替尼对细胞异质性的动态影响。结果B组克隆形成数高于亲代细胞组(P<0.01),A、D、E组克隆形成数低于亲代细胞组(P均<0.05)。B、F组细胞培养48、72、96、120 h时的增殖倍数与亲代细胞组相比,P均<0.05;C、D组细胞培养72、96、120 h时的增殖倍数与亲代细胞组相比,P均<0.05;其中B组细胞增殖倍数最高,D组细胞增殖倍数最低。B组细胞为对吉非替尼最敏感的细胞组,其余各组细胞对吉非替尼的IC50值与亲代细胞组相比,P均<0.05,其中D组细胞为对吉非替尼IC50值最高的细胞组。亲代细胞组与A^F组细胞均为EGFR基因19 Del突变。D组细胞HER2基因扩增为阳性、MET基因扩增为阴性,而亲代细胞组和A、B、C、E、F组细胞HER2基因和MET基因扩增均为阴性。在吉非替尼压力下,吉非替尼敏感B克隆细胞和耐药D克隆细胞等比例混合培养2周后耐药细胞获得绝对生长优势,B克隆细胞与亲代细胞等比例混合培养2周后少量残留细胞中亲代细胞存在相对优势,D克隆细胞与亲代细胞等比例混合培养2周后两细胞均势生长。结论HCC827细胞在增殖能力、药物敏感性等表型层面和驱动基因等遗传背景层面均存在克隆异质性,并且其克隆异质性与吉非替尼敏感性有关。

肿瘤相关巨噬细胞——抗肿瘤转移的新靶点

肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用是促成恶性肿瘤转移的必要条件。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞,是肿瘤微环境中最多的免疫细胞。肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤侵袭转移过程中发挥了关键性作用,使得TAM成为抗肿瘤转移治疗的重要靶点。本文主要就TAM极化及其促进肿瘤侵袭转移的相关分子机制作一述评。

Hsa-miR-17基因启动子区PCR扩增及鉴定体系的构建

目的建立Has-miR-17编码基因启动子区的PCR扩增及鉴定体系。方法提取人源细胞系基因组DNA为实验样本,以Has-miR-17编码基因上游启动子区序列为目标序列,行序列特征分析并设计特异PCR扩增及测序引物,利用添加DMSO和使用5’加尾引物的体系优化策略建立Has-miR-17基因启动子区PCR扩增及鉴定体系并行性能评估。同时另以10例人源细胞系为样本初步验证该PCR及鉴定体系的应用效果。结果经电泳鉴定与测序分析确认在联合使用5'加尾PCR引物和5%DMSO的条件下Has-miR-17基因启动子区PCR扩增及鉴定体系已成功建立,其检测下限达10 ng/μl且特异度好、重复性佳。利用该体系成功实现对10例人源细胞株Has-miR-17基因启动子区的PCR扩增及鉴定。结论已成功建立Has-miR-17编码基因启动子区的PCR扩增及鉴定体系。

肿瘤相关巨噬细胞促进乳腺癌细胞T47D侵袭和迁移

目的探讨活化的肿瘤相关巨噬细胞对乳腺癌T47D细胞侵袭和迁移的影响。方法使用佛波酯(PMA)体外诱导单核细胞THP-1,并用白细胞介素4(IL-4)诱导建立活化的肿瘤相关巨噬细胞模型。用未活化M0型和活化的M2型巨噬细胞培养液上清处理乳腺癌细胞T47D,细胞划痕实验和transwell实验检测T47D细胞迁移和侵袭能力。qRT-PCR和Western blot实验检测细胞上皮-间质转化(EMT)标志物的表达。结果成功建立未活化M0型巨噬细胞和M2型肿瘤相关巨噬细胞模型。采用巨噬细胞培养上清处理T47D细胞,结果发现与M0型巨噬细胞培养上清相比,M2型巨噬细胞上清显著增加T47D细胞的侵袭和迁移能力。qRT-PCR和Western blot提示M2型巨噬细胞上清可显著下调钙黏附蛋白E(E-cadherin),上调波形蛋白(vimentin)、钙黏附蛋白N(N-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达。结论活化的M2型肿瘤相关巨噬细胞可促进乳腺癌细胞T47D发生EMT表型改变,进而增加T47D细胞侵袭和迁移能力。

LncRNA RP11-316M1.12促进乳腺癌细胞侵袭转移

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA) RP11-316M1. 12在乳腺癌中的作用及相关机制。方法生物信息学统计RP11-316M1. 12在乳腺癌组织及正常组织中的表达量,qRT-PCR方法检测RP11-316M1. 12在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中的表达量,统计分析RP11-316M1. 12的表达量与乳腺癌临床特征的关系。在MCF-7细胞中过表达RP11-316M1. 12,在MDA-MB-231细胞中敲低RP11-316M1. 12,Transwell方法检测上述细胞的侵袭能力,Western blot技术检测上述细胞上皮间质转化(EMT)标志物的表达。结果 GEPIA数据库资料显示RP11-316M1. 12在乳腺癌组织中表达量显著高于正常组织。qRT-PCR检测在65例乳腺癌组织和23例癌旁组织中得到相似的结果,且发现RP11-316M1. 12在乳腺癌细胞中的表达量高于乳腺正常上皮细胞。RP11-316M1. 12表达与乳腺癌TNM分期及远处转移有关。Transwell结果显示过表达RP11-316M1. 12可促进MCF-7细胞的侵袭能力,而敲低RP11-316M1. 12可显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。机制研究发现过表达RP11-316M1. 12可下调E-cadherin,同时上调Vimentin和ZEB1。结论 RP11-316M1. 12在乳腺癌中高表达且增强乳腺癌细胞侵袭能力。