环介导恒温扩增法检测肉制品中致病微生物

目的:建立一种食品中微生物核酸快速检测技术,在此基础上开发的简便、快速、灵敏,不依赖仪器适合基层应用的核酸快速检测试剂盒;并探索该试剂盒在肉及肉制品微生物检测中的应用。方法:根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列vir R基因设计引物,采用环介导恒温扩增技术构建检测体系,优化、验证检测的特异度、检出限等指标,并与传统分离培养法比较。结果:本研究中的检测方法及试剂盒能专一的检出肉制品中的单增李斯特菌,对其他近源菌株检测呈阴性结果,检出限达1.81×103CFU/mL,与传统方法具有相同的灵敏度;检测操作简便快速,极少的设备依赖,适合规模推广。

“LAMP基因快速检测技术平台及重要食源性致病微生物系列试剂盒开发”项目简介

广州华峰生物科技有限公司成立于2006年1月，注册资金500万。主要业务包括研究开发体外诊断试剂、生物治疗药物、保健品及相关技术服务。

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌。方法针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法。通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性。结果活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×102cfu/ml,在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×103cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×104cfu/ml。检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%。结论建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查。

LAMP技术检测结核分枝杆菌试验性研究

目的建立并评价环介导等温扩增技术检测结核分枝杆菌方法。方法选择临床痰标本培养的结核分枝杆菌分离物14份,非结核分枝杆菌阳性分离物14种31份,痰标本11份,以H37Rv、BCG为阳性对照,提取DNA后,用自主研发的环介导等温扩增检测技术进行检测,统计该技术对结核分枝杆菌检测的灵敏性和特异性。结果该技术对结核分枝杆菌分离物检测结果灵敏性为100%(14/14),对非结核分枝杆菌分离物检测结果特异性为100%(31/31),对人结核分枝杆菌标准菌株H37Rv、BCG检测结果均为阳性;方法的检出限为12cfu。对临床痰标本中的结核分枝杆菌检测结果与罗氏培养基培养结果一致。结论环介导等温扩增检测结核分枝杆菌技术灵敏性和特异性高,具有简便易行、快速准确的特点,适合于基层结核病诊断实验室推广应用。

改良LAMP法检测转基因作物

目的建立简易的可视化环介导等温扩增(LAMP)检测转基因作物的方法。方法通过一对特异的能识别一段正义链和一段反义链的内引物和一对链置换引物,在Bst DNA聚合酶作用下,以等温条件实现对外源转基因成分的扩增,反应液和高浓度的显色液SYBR GREENⅠ同时置于特殊设计的反应管中,反应后可实现闭管可视化检测。结果对转基因作物中常见的外源基因元件胭脂碱合成酶终止子(T-NOS)和烟草花叶病毒35S启动子(P-CaMV35S)进行了LAMP检测。T-NOS LAMP对大米品系BT63,玉米品系BT11,MON810,大豆品系GTS40-3-2的检测结果呈阳性,P-CaMV35S LAMP对大米品系BT63,玉米品系BT11,MON810,MON863,大豆品系GTS40-3-2的检测结果呈阳性,二者对非转基因大米,玉米,大豆的检测结果均呈阴性。上述结果表明,本文中建立的T-NOS和P-CaMV35S LAMP检测方法特异性高。另外,通过对大豆品系GTS40-3-2模拟样品的检测,证明T-NOS LAMP能检出转基因成分含量为0.5%的样品,P-CaMV35S LAMP能检出转基因成分含量为0.1%的样品,检测灵敏度较高。结论改良LAMP法灵敏度高,特异性好,能用于快速初筛转基因作物。

单核细胞增生李斯特氏菌LAMP试剂盒的研制及在食品检测中的应用

利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立食品中单增李斯特氏菌的检测方法。通过对反应条件的优化,组装单增李斯特氏菌LAMP检测试剂盒,并对其特异性、敏感性和适用性进行验证。试验结果显示:该试剂盒适用于食品中单增李斯特氏菌的快速检测,用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达17CFU/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测120种样品中的单增李斯特氏菌,两种方法的符合率达100%。该试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。

嗜肺军团菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用

目的建立一种灵敏、快速、安全、方便适合口岸现场应用的嗜肺军团菌检测方法。方法分析嗜肺军团菌基因组序列,选择特异性基因片段设计引物,建立环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LMAP)方法,并优化反应条件。结果建立的方法特异性好,灵敏度可达103cfu/ml,检测能力与荧光定量PCR法相当。结论应用环介导恒温扩增技术建立的嗜肺军团菌检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。