甲醇酵母表达系统高拷贝数整合型表达载体的构建

以甲醇酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）表达系统的ＹＩｐ型表达载体ｐＪＦ５１为基础，通过引入宿主来源的一个ｒＤＮＡ随机顺序和由ＳＶ４０早期启动子控制的Ｇ４１８抗性基因（ｎｅｏ）及对野生型标记基因Ｈｐｌｅｕ２启动子大部分上游序列的缺失，构建了一个高拷贝整合型表达载体ｐＭＩＲＨ。有关转化、筛选和拷贝分析等试验结果表明，由ｐＭＩＲＨ可产生含高拷贝数载体的转化子，并可通过由ｌｅｕ２＋筛选和Ｇ４１８抗性筛选所组成的二级筛选方法富集这些含高拷贝数载体的转化子。有关完整ＤＮＡ和消化ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析结果进一步表明，上述高拷贝数的载体以串联重复排列的方式整合于宿主基因组。

重组人表皮生长因子体外生物活性的测定

目的：探讨适合本实验室用M7TT或MTS／PMS检测重组人表皮生长因子（rhEGF）的一系列实验参数，包括血清浓度、细胞浓度、细胞培养时间和酶解程度。方法：利用MTF或MTS／PMS结合酶标仪分别在多种实验条件下对重组人表皮细胞因子进行了生物活性检测，同时绘制细胞生长曲线，对细胞生长状态拍照观察。结果：血清浓度为0．5％，细胞浓度为5000－7000个／孔，细胞铺满率为70％－80％及酶解适当时，用MTT和MTS／PMS都测得ED50约为0．6ng／ml，与标准品相符。结论：改进后的实验条件下，MTT和MTS／RMS都可用于rhEGF的生物活性检测。

甲醇酵母表达系统pMIRH型载体研究

在为甲醇酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）表达系统成功构建高拷贝整合型表达载体ｐＭＩＲＨ－１的基础上，构建了更能满足外源基因表达需要的、大小仅为７３００ｂｐ的高拷贝整合型表达载体ｐＭＩＲＨ－２．有关转化、筛选及传代稳定性试验结果表明，ｐＭＩＲＨ－２亦具有与ｐＭＩＲＨ－１相似的转化和筛选特性及高拷贝整合能力，且二者均可在非选择条件下稳定传代６０代以上．