增城与广州地区乙型肝炎病毒基因分型比较研究

目的增城地区与广州地区的乙型肝炎病毒基因型的差异性比较.方法利用荧光PCR法对HBV携带者进行基因分型。结果增城地区B型占87.0%,C型占11.6%,BC混合型占1.4%,没有发现D型;广州地区B型占48.9%,C型占43.7%,BC混合型占6.5%,D型占0.9%。结论增城与广州HBV DNA基因分型存在一定差异。

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B^D方法并验证其准确性。方法比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列,设计特异的组合引物探针,应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患者血清标本进行基因型B、C、D检测,并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果128例标本中B型检出率为20.3%(26/128),C型71.9%(92/128),D型7.8%(10/128);18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型,适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。

荧光聚合酶链反应技术在乙型肝炎病毒基因分型中的应用

目的 探讨适合临床检验和科研应用的乙型肝炎 (乙肝 )病毒基因分型方法 ,研究荧光聚合酶链反应技术 (PCR)技术在HBV DNA基因分型中的实用性和可行性 ,了解广州地区儿童乙肝无症状携带者HBVDNA的基因型。方法 设计两对扩增S基因引物 ,3条针对B、C、D基因型荧光探针 ,进行荧光PCR检测。结果 广州地区HBVDNA的基因型以B型和C型为主 ,其中B型 6 2 .7% ,C型 35 % ,B、C混合型 3.3%。结论 荧光PCR基因分型方法在实际应用中分型率高 ,操作相对简便 。

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike,S)蛋白的免疫学特性,以及S蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达,经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb;将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB,得到重组DNA疫苗pSecS,免疫小鼠,得到SAS-CoVS蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS-CoVS抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应,原核表达的重组分段S蛋白具有SARS-CoVS蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,这为进一步SARSDNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。

SARS冠状病毒M蛋白的原核表达及其DNA疫苗构建

为探讨SARS CoV的M蛋白的免疫学特性以及M蛋白作为SARS CoV病毒疫苗组分的可行性和必要性。分别用pET 15b和pET 22b在大肠杆菌中表达SARS CoV的M蛋白,亲和层析纯化后作为抗原应用。同时,将M蛋白的编码基因克隆进分泌型真核表达载体pSecTagB中得到重组质粒pSecM作为DNA疫苗,免疫BALB/c小白鼠、制备SARS CoV M蛋白的抗血清。并用纯化后的M蛋白建立的SARS CoV M抗体ELISA检测技术研究所构建的M DNA疫苗的免疫效果。结果表明:两种重组M蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,经与华大产的用灭活SARS全病毒制备的SARS CoV抗体ELISA检测试剂盒比较实验,证明该原核表达的重组M蛋白能与SARS确诊病人血清以及M DNA免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应。这两种重组M蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS CoV检测中;所构建的SARS CoV的M基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,提示M蛋白在SARS CoV疫苗尤其是组分疫苗的研制中应加以考虑,为DNA疫苗的开发提供了依据。

SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建

目的:在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白,并构建其DNA疫苗。方法:构建含N基因的原核表达载体pQEN,并在大肠杆菌M15中表达N蛋白。采用Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白。将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中,构建真核重组质粒pSecN。以其免疫小鼠制备抗血清,并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性。结果:重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应;SARS-CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应。结论:重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位,可作为用ELISA法检测SARS-CoV的抗原。构建的DNA疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体,从而为该疫苗的开发奠定了基础。

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型方法的建立和临床研究

目的建立实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型方法并对检测的慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型进行临床分析。方法根据GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列,设计特异的组合引物探针,建立实时荧光PCR方法,检测128例慢性乙型肝炎患者基因型;同时检测HBVDNA、HBVM。结果(1)128例标本中B型检出率为20.3%(26/128),C型占71.9%(92/128),D型占7.8%(10/128);18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。(2)男性与女性的HBV基因型构成比无明显差异(P=0.561)。B型与C型比较,C基因型HBVDNA含量(P<0.05)和HBeAg阳性率(P<0.01)明显高于B基因型。基因型B具有更高的HBeAb水平(P<0.05)。结论(1)实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型。(2)HBV基因型主要以C型为主,其次为B型、D型。在CHB患者中,性别不是基因型构成差别的因素,C基因型易引起较重的肝脏病变,B型易发生免疫逃逸,致病情较轻。

乙型肝炎病毒三种基因分型方法的比较分析

随着乙型肝炎病毒（HBV）全基因序列测定病毒株的增多，近年人们开始根据生物系统发生学中的基因分类法建立HBV的基因分型技术和标准。对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊断与治疗进行更加深入细致的研究，现有研究表明不同亚型HBV感染的临床病程和对治疗的反应都存在一定的差异。我们分别应用自行建立的实时荧光聚合酶链反应（PCR）法、HBVS基因测序法和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）法对75例慢性乙型肝炎患者的血清基因型进行检测，并对检测结果进行分析比较。