利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER ARPC2表达载体 ,并在真核细胞中进行表达 ,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列 ,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER .basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后 ,转染HEK 2 93细胞 ,利用RT PCR和Westernblot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER ARPC2载体导入HEK 2 93细胞时 ,ARPC2基因的表达受到抑制 ,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体 ,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用 ,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。

KCNE2的两种突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的调节

Mink相关蛋白1(MiRP1)是由KCNE基因家族成员KCNE2编码的具有一个跨膜结构的小分子蛋白质,发生在KCNE2上的相关突变能够引起遗传性长QT间期综合症(long QT syndrome,LQT6),但其机制不明.以往的工作表明,MiRP1调节瞬间外向钾电流(transient outward current,Ito)的功能,对维持心电稳定性具有重要的调节作用.在哺乳细胞系COS-7表达系统利用膜片钳全细胞记录方式,研究了两种LQT6相关的突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的影响,从MiRP1对Ito功能调控的改变探讨LQT6引起心律失常的电生理机制.结果表明,KCNE2与Kv4.3共表达后对通道功能具有明显的调控作用,使通道的激活和失活明显减慢,电压依赖性失活发生正向移位,同时加快Kv4.3通道从失活中的恢复.I57T与Kv4.3共表达的通道,门控动力学以及通道的恢复特性更接近Kv4.3单独表达的通道,表现为丧失KCNE2的功能——"loss of function",而V65M的作用则与之刚好相反,对Kv4.3门控动力学和恢复特性的调节较KCNE2更强,同时,使通道电流密度明显降低,表现为增强KCNE2的功能——"gain of function".由此推论,KCNE2对Ito功能有重要的调节作用,发生在KCNE2基因上的突变,无论是增强(V65M)还是减弱(I57T)KCNE2的功能都可能通过改变Ito在心脏电稳定性中的贡献,从而使心脏在某些条件下发生心律失常.

大鼠耳蜗背核神经元第一动作电位延时的特性

目的:探讨大鼠耳蜗背核神经元第一动作电位延时的特性。方法:采用在体细胞外记录方法,通过给予单耳不同频率和声强的短纯音刺激,记录成年SD大鼠耳蜗背核神经元反应,并分别以动作电位发放数(spike counts,SC)和第一动作电位延时(first spike latency,FSL)为评价指标,分析比较它们对同一刺激的反应稳定性。结果:共记录到21个单单位(single-unit)神经元反应。这些神经元均以burst spikes这种多放电率的形式发放。以发放数为评价指标,这些神经元分别表现出单调(76%)、饱和(19%)和非单调(5%)三种声强反应。而第一动作电位延时展示出同一规律的FSL-声强反应曲线:FSL随着声强的增大而缩短。SC-频率曲线呈现多形性,而FSL-频率曲线呈"V"字型。结论:在大鼠耳蜗背核神经元,相比发放数,第一动作电位延时对同一刺激的反应稳定性更好。

声长对小鼠下丘神经元声强反应关系的影响

目的：探讨声长（sound duration）对听神经元声音强度反应关系的影响。方法：采用在体细胞外记录方法,通过给予双耳不同声长和声强的特征频率（characteristic frequency,CF）短纯音刺激,记录4-6周BALB/c小鼠下丘神经元听反应,并分别以动作电位发放数（spike counts,SC）和第一发放延时（first spike latency,FSL）为评价指标,分析比较声长对神经元的声强反应关系的影响。结果：共记录到35个神经元反应。以发放数为评价指标,这些神经元分别表现出34%单调、26%饱和、40%非单调3种声强反应。较之发放数,FSL能更好地反映声强和声强变化,并展示出同一规律的FSL-声强反应曲线：FSL随着声强的增大而缩短。在不同声长下,所有神经元发放数-声强曲线和FSL-声强曲线基本重合,但后者变异性小。结论：声长对小鼠下丘神经元强度反应关系无明显影响;相比发放数,FSL则能更准确地反映声强和声强变化。