利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER ARPC2表达载体 ,并在真核细胞中进行表达 ,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列 ,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER .basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后 ,转染HEK 2 93细胞 ,利用RT PCR和Westernblot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER ARPC2载体导入HEK 2 93细胞时 ,ARPC2基因的表达受到抑制 ,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体 ,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用 ,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。

KCNE2的两种突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的调节

Mink相关蛋白1(MiRP1)是由KCNE基因家族成员KCNE2编码的具有一个跨膜结构的小分子蛋白质,发生在KCNE2上的相关突变能够引起遗传性长QT间期综合症(long QT syndrome,LQT6),但其机制不明.以往的工作表明,MiRP1调节瞬间外向钾电流(transient outward current,Ito)的功能,对维持心电稳定性具有重要的调节作用.在哺乳细胞系COS-7表达系统利用膜片钳全细胞记录方式,研究了两种LQT6相关的突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的影响,从MiRP1对Ito功能调控的改变探讨LQT6引起心律失常的电生理机制.结果表明,KCNE2与Kv4.3共表达后对通道功能具有明显的调控作用,使通道的激活和失活明显减慢,电压依赖性失活发生正向移位,同时加快Kv4.3通道从失活中的恢复.I57T与Kv4.3共表达的通道,门控动力学以及通道的恢复特性更接近Kv4.3单独表达的通道,表现为丧失KCNE2的功能——"loss of function",而V65M的作用则与之刚好相反,对Kv4.3门控动力学和恢复特性的调节较KCNE2更强,同时,使通道电流密度明显降低,表现为增强KCNE2的功能——"gain of function".由此推论,KCNE2对Ito功能有重要的调节作用,发生在KCNE2基因上的突变,无论是增强(V65M)还是减弱(I57T)KCNE2的功能都可能通过改变Ito在心脏电稳定性中的贡献,从而使心脏在某些条件下发生心律失常.