人单核细胞THP-1源性泡沫细胞内雷帕霉素含量测定的HPLC法的建立及应用

目的:建立人单核细胞THP-1源性泡沫细胞内雷帕霉素(RAPA)含量的测定方法,研究RAPA靶向制剂(RAPA-NP-Apt)对泡沫细胞的靶向作用。方法:以氧化型低密度脂蛋白诱导THP-1细胞建立泡沫细胞模型,取200 ng/m L的RAPA和200、400、800ng/m L的RAPA-NP-Apt与泡沫细胞共同孵育60 min。采用高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内RAPA含量,色谱柱为Diamonsil C18,流动相为乙腈-水(90∶10,V/V),流速为1.0 m L/min,柱温为40℃,检测波长为278 nm,进样量为20μL。结果:RAPA检测质量浓度线性范围为50~6 400 ng/m L(r=0.999 96),平均回收率为98.72%(RSD=0.62%,n=3),日内、日间RSD均不大于6.15%(n=6),稳定性试验的RSD<2%(n=6),重复性试验的RSD=1.64%(n=6)。RAPA和低、中、高质量浓度的RAPA-NP-Apt与泡沫细胞共孵育后RAPA的含量分别为12、43、98、140 ng/10~6个细胞。结论:本方法操作简单,稳定性和重复性好,可用于泡沫细胞内RAPA的含量测定。RAPA-NP-Apt可提高RAPA对泡沫细胞的靶向作用。

高特异性心肌肌钙蛋白Ⅰ适配体的ePCR技术筛选及其表征

目的筛选出与心肌肌钙蛋白I(cTnI)具有高亲和力和高特异性的核酸适配体,为诊断急性心肌梗死(AMI)提供实验基础。方法采用基于乳液PCR(ePCR)的SELEX技术筛选出能与cTnI特异性结合的3个适配体,并对ePCR条件进行优化,对适配体进行亲和力(Kd值)测定并与市售cTnI抗体进行比较,选出Kd值最小的适配体,进行特异性鉴定。结果SELEX过程中通过优化得到ePCR最佳条件,筛选得到的3个适配体均对cTnI具有较强的亲和力,其Kd值范围为2.04~16.85 nmol/L,其中适配体Apt-1的亲和力最强[Kd为(2.04±0.11)nmol/L]且优于市售抗体,特异性高,敏感性强,不与其他相关蛋白有非特异性结合。结论筛选出的适配体Apt-1能与cTnI产生高亲和力的特异性结合,可进一步用于临床样本中cTnI的检测。

结直肠癌细胞靶向适配体的Cell-SELEX筛选研究

目的:筛选特异性靶向早期结肠癌高亲和力的适配体,为结肠癌的诊断和治疗提供新的手段。方法:利用结肠癌细胞HCT116作为正筛细胞,非瘤细胞系作为反筛细胞,通过Cell-SELEX的方法筛选一组靶向结肠癌的适配体,并通过confocal和ELONA法验证特异性和亲和力。结果:得到100个靶向结肠癌细胞的适配体序列,能特异性靶向结肠癌细胞HCT116,其结合亲和力在8~22 nmol/L,其中适配体AptH8与HCT116细胞的结合Kd值为(8.81±0.36)nmol/L。结论:筛选得到的适配体能特异性靶向HCT116细胞并具有很高的亲和力,可作为进一步研究的靶分子。