褥式与褥式外翻缝合法行主动脉瓣置换的临床对比

目的分析比较间断褥式与褥式外翻缝合法行主动脉瓣置换(AVR)术后主动脉瓣有效瓣口面积、跨瓣压差、心功能的变化以及相关并发症的发生情况,探讨两种不同缝合方法的优缺点。方法随机选取63例行AVR的患者为研究对象,其中34例行间断带垫片褥式缝合,29例行间断带垫片褥式外翻缝合。术后临床随访观察患者主动脉瓣有效瓣口面积,以及跨瓣压差、心功能的变化和相关并发症的发生情况,随访时间4～81个月,平均(37.23±15.79)月。结果术后1例因无法复跳、1例因主动脉切口出血而早期死亡,1例术后5个月出现脑出血,全组病人术后无脑血栓及瓣周漏发生。2组患者相对比,术前一般资料及术后并发症(包括出血、血栓形成、瓣周漏和冠脉开口受影响等)无显著差异(P>0.05),褥式缝合组术后有效瓣口面积比褥式外翻组高(P<0.05)、主动脉跨瓣压差较后者低(P<0.05)、术后左室射血分数(LVEF)比后者高(P<0.05)、主动脉阻断时间较后者缩短(P<0.05)。结论在AVR手术中用褥式缝合法较褥式外翻法可以增大主动脉瓣有效瓣口面积、降低主动脉跨瓣压差、缩短主动脉阻断时间、有利于手术后左心功能的恢复,而相关并发症与褥式外翻组无显著性差异。

内皮衍生微粒诱导内皮细胞氧自由基产生损伤内皮功能

目的:探讨内皮衍生微粒(EMP)诱导内皮功能失调的机制和氧自由基(O2.-)在EMP诱导内皮功能失调中所起的作用。方法:从人血纤维蛋白溶酶原激活抑制剂-1刺激的人脐静脉内皮细胞中提取EMP,(1)采用牛主动脉内皮细胞(BAEC)做细胞培养,分成3组。第1组不做预处理,第2组EMP(1×108/L),第3组EMP(1×108/L)+L-nitroarginiemethylester(L-NAME,1mmol/L),预处理BAEC30min后,用超氧化物歧化酶(SOD)可抑制的铁细胞色素C还原法,测量O.2-的产生情况。(2)从小鼠中分离面动脉,分成4组。第1组不做预处理,第2组EMP(1×108/L),第3组EMP(1×108/L)+SOD(2×105U/L),第4组EMP(1×108/L)+聚乙烯羟乙酸盐超氧化物歧化酶(PEG-SOD,2×105U/L)预处理血管10min后做乙酰胆碱(ACH)诱导下的内皮依赖血管舒张功能试验。结果:(1)EMP明显增加BAECO.2-产生,L-NAME可以抑制50%EMP导致的O.2-产生增加。(2)EMP明显损伤ACH诱导的血管舒张功能,SOD处理未能清除EMP对血管舒张功能的损伤,PEG-SOD可部分恢复EMP处理后的血管舒张功能。结论:EMP诱导血管内皮功能失调至少部分是通过诱导细胞内产生的O2.-所致,为将来寻找包括清除O.2-在内的综合治疗方法提供理论依据。

炎症性肠病及其干细胞移植再生修复

炎症性肠病(IBD)在我国发病率逐步升高,其相关病理学研究和再生修复成为研究的热点.炎症性肠病存在易感基因NOD2,发病与感染、饮食、药物、肠道菌群变化及免疫因素有关.肠道干细胞,具有自我更新与增殖能力.肠黏膜被破坏时,陷窝残存的干细胞向外生长并移行,重建绒毛直至肠黏膜恢复正常.肠道干细胞的增殖和分化与多种细胞因子作用有关.造血干细胞移植治疗IBD是最近出现的一种新型治疗方法,自体与异体移植均有较好临床疗效,基础研究已经证实移植的造血干细胞可以定居于肠道上皮,但移植修复损伤肠道黏膜的详细机制则有待于深入研究.

脐血体外同时扩增造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞

目的:探索体外同时扩增脐血中造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞的可能性和最佳细胞因子组合方案。方法:采集健康正常足月产新生儿脐血,分离出单个核细胞,在不同的细胞因子组合作用下培养14天。培养于0、3、7和14天时收集细胞,用FCM分析扩增前后脐血CD34+、CD3+T及DCs细胞含量。结果:3组不同细胞因子组合实验组A:SCF+IL3,6;B:SCF+IL3,6,4;C:SCF+IL3,6,4(5×)均能显著扩增脐血中的单个核细胞和CD34+细胞,各组的CD34+细胞最高值出现在第7天,CD34+细胞平均增加倍数10～20倍不等。在扩增初期,各组CD3+T有所下降,7天时CD3+T细胞有不同程度的增加,14天时扩增最高的组别中CD3+T细胞是新鲜脐血的2倍。DCs标志CD1a、CD80、CD83和CD86,在所有组别中培养3天时有所下降,第7天时在含IL4的组别中有显著上升,且CD1a和CD80表达高于CD83和CD86;14天时则有所回落。IL4对CD34+和CD3+T细胞扩增有一定促进作用。结论:脐血中T细胞、DC细胞在一定细胞因子组合下,可与CD34+细胞同时在体外被扩增和诱导分化。

bmi-1shRNA逆转录病毒表达载体的构建及稳定转染LoVo细胞系的建立

目的构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,建立稳定转染的LoVo细胞系,探讨稳定转染bmi-1shRNA对大肠癌细胞LoVo靶基因表达的影响,为下一步应用RNAi技术治疗打下基础。方法设计合成靶向bmi-1基因编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,另设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-C,载体经脂质体2000介导转染LoVo细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定转染的LoVo细胞系,显微镜观察、MTT检测、荧光定量PCR、Western blot检测bmi-1表达受抑后对细胞的增殖影响。结果成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体,建立了稳定转染的LoVo细胞系,bmi-1shRNA对LoVo细胞bmi-1mRNA表达抑制率为80%、bmi-1蛋白抑制率为82%,P<0.05。结论针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞LoVo的增殖能力,bmi-1mRNA与蛋白表达受抑制,但对细胞形态学无明显影响。

脐血体外同时扩增T、NK及干祖细胞移植治疗BALB/c小鼠白血病

目的:观察体外同时扩增T、NK及干祖细胞脐血用于移植治疗BALB/c小鼠白血病效果。方法:在不同的细胞因子组合作用下定向扩增脐血干祖细胞及T、NK免疫细胞。扩增7天后,5×106个/只脐血细胞经尾静脉接种X射线照射的白血病小鼠,观察各组小鼠存活时间及检查存活证据及微小残留白血病细胞。结果:1.细胞因子SCF,IL-3,IL-6,IL-7,IL-2组合能显著扩增脐血中的CD34+、CD3+T、NK细胞。2.尾静脉接种2×106个/只K562产生可移植性白血病BALB/c裸鼠。3.BALB/c白血病小鼠移植6周后,实验组共存活鼠12只。而未移植者在60天内死于肿瘤。4.流式细胞分析移植30天后小鼠外周血中人CD3+细胞从最低新鲜脐血移植组(0.48±0.40)%,最高SCF+IL-3,6,7组中为(3.01±1.25)%。RT-PCR检测发现,在12只扩增后移植存活6周小鼠中,检测不到bcr/abl基因。在3只新鲜脐血移植存活6周的小鼠中,1只呈现阳性,说明移植取得了造血与免疫重建。所有脐血移植小鼠均未出现明显临床GVHD症状。结论:这种扩增后含一定水平T、NK免疫细胞的脐血能重建可移植性BALB/c白血病小鼠的造血和免疫。

慢病毒介导稳定过表达β-catenin可促进间充质干细胞的增殖和迁移

背景:β-catenin是wnt/β-catenin信号通路中最关键的信号分子,参与调控细胞增殖、分化以及组织自我修复的平衡。目的:建立慢病毒介导的过表达β-catenin基因的大鼠间充质干细胞株,观察β-catenin基因对间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体pLV-catenin-RFP,采用人胚肾上皮细胞293T进行包装,收集、浓缩病毒,感染间充质干细胞株,经过嘌呤霉素加压筛选,建立稳定过表达β-catenin基因的间充质干细胞。通过实时荧光定量PCR、细胞生长曲线、MTT实验、Transwell体外细胞迁移实验研究稳定过表达β-catenin基因对间充质干细胞增殖和迁移的影响。结果与结论:成功包装靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体pLV-catenin-RFP,建立稳定过表达β-catenin基因的间充质干细胞。与空载对照pLV-RFP组和正常间充质干细胞组相比,实时荧光定量PCR证实,慢病毒pLV-catenin-RFP组mRNA表达明显增高(P<0.05);MTT和生长曲线显示pLV-catenin-RFP组使细胞倍增时间缩短(P<0.05),增殖能力增加;细胞迁移实验显示pLV-catenin-RFP组使细胞迁移能力增加(P<0.01)。结果可见慢病毒介导稳定过表达β-catenin基因能使间充质干细胞的增殖能力及迁移能力增强。

国产PN－2000A呼吸机围术期的应用

国产ＰＮ－２０００Ａ呼吸机围术期的应用佘守章，彭宪，邱卫东，刘继云，罗禄萍，胡善我院于１９９２年６～９月应用广东普宁医疗器械厂生产的ＰＮ－２０００Ａ呼吸机，进行了动物实验与围术期应用，效果满意，现就临床应用情况报告如下。临床资料全组３１例病人，男性１...

左旋精氨酸恢复肺动脉高压一氧化氮和氧自由基的平衡

【目的】探讨左旋精氨酸(l-Arg)对大鼠中期肺动脉高压(PH)的防治作用及机理。【方法】将18只雄性SD大鼠随机分为3组,对照组(C组,n=6)、PH组(M组,n=6)、l-Arg+PH组(L组,n=6)。于M组和L组用野百合碱(MCT)一次腹膜腔注射诱导PH模型,L组每天进行腹膜腔注射l-Arg。21d后用右心导管法测定右心室收缩压(RVSP);用化学比色法检测血浆中一氧化氮(NO)水平;用Hydroethidine进行肺灌注测量肺组织氧自由基(O2誗-)的产量。【结果】M组RVSP(31±5)mmHg明显高于C组(12±5)mmHg,而L组(23±5)mmHg比M组有所下降。血浆NO水平M组(11±7)μmol/L比C组(24±6)μmol/L低,而L组(22±12)μmol/L恢复到近C组水平。肺组织O2誗-含量M组(41±5)U明显高于C组(18.1±1.0)U,L组(27±3)U介于C组与M组之间。【结论】在PH中NO与O2誗-的平衡被打破,l-Arg可恢复PH中NO与O2誗-的平衡,这可能是L-Arg降低肺动脉压力的原因。

干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达

背景:肿瘤细胞有多种干细胞标记的表达,深入研究其表达规律有助于揭示肿瘤发病机制、完善肿瘤干细胞理论。目的:检测大肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1与癌旁组织的表达差异,以及CD133免疫磁珠分选阳性与阴性SW620细胞中上述基因的表达差异。方法:选临床病理诊断清楚的29例大肠癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达。CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133细胞与CD133阴性细胞RNA,RT-PCR检测分选后上述基因的表达差异。结果与结论:29例标本均诊断为低、中分化腺癌或黏液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值癌组织表达均高于癌旁组织(P<0.05)。RT-PCR检测分选后CD133+细胞CD133,CD166,Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133-细胞。提示,CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1相关干细胞标记可作为大肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断检测。

TIMP-3对肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移的影响

目的建立以真核表达载体介导的过表达TIMP-3基因的肝癌细胞株(SMMC-7721和HepG2),探讨TIMP-3基因对两细胞增殖、凋亡、周期、侵袭等功能的影响。方法将TIMP-3质粒pCMV6-AC-GFP/TIMP-3(TIMP-3组)和空载对照质粒pCMV6-AC-GFP(对照组)稳定转染入SMMC-7721和HepG2细胞株,用Western blot技术检测细胞内TIMP-3蛋白的表达,通过MTS实验、流式细胞术、侵袭实验测定细胞的各种生物学行为。结果 Western blot检测结果显示,TIMP-3组的SMMC-7721和HepG2细胞高表达TIMP-3蛋白,而对照组细胞没有TIMP-3蛋白表达。MTS实验和流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,TIMP-3组两种细胞的增殖能力显著减弱(第5天时P=0.003,P=0.009),凋亡率显著升高(P=0.001,P=0.038),细胞周期停滞于G2/M期(P=0.030,P=0.034);体外侵袭实验结果显示,TIMP-3组两种细胞的侵袭能力较对照组显著下降(P=0.033,P=0.015)。结论 TIMP-3能显著抑制SMMC-7721及HepG2细胞的增殖和侵袭能力,并诱导细胞发生凋亡和产生G2/M期阻滞。

应用干细胞分离仪分离脐血与传统手工分离法的效果比较

目的:脐血处理的关键问题是提高干细胞的回收率及实现处理过程的标准化和可重复化,实验对此进行探讨,比较干细胞分离仪与传统羟乙基淀粉手工法分离脐血的效果。方法:实验于2006-12/2007-05在广州医学院附属市一人民医院完成。①脐血来源:39份脐血采自广州医学院附属市一人命医院妇产科健康顺产新生儿脐带,产妇均知情同意。随机数字表法分为仪器分离组17份、手工分离组22份。②实验方法:仪器分离组收集脐血称质量,计算体积,在开始处理前20min缓慢加入相当于20%脐血体积的60g/L羟乙基淀粉。仪器分离组按仪器要求自动分离,分离终体积20mL。手工分离组50g离心5min,压浆板压出全部血浆以及18mL红细胞移至无菌空袋,500g离心13min,自动压浆板压出血浆,保留20mL终体积样本。③实验评估:采用全自动计数仪进行检测有核细胞(白细胞)、红细胞数量。流式细胞仪分析CD34+含量。结果:采用干细胞分离仪处理浓缩脐血,有核细胞回收率为(89.7±3.4)%,CD34+细胞回收率为(98.8±5.1)%,红细胞去除率为(55.2±16.7)%,均比手工分离组分离效果好,差异有显著性意义(P<0.05或0.01)。同时,仪器分离组有核细胞回收率、CD34+细胞回收率的标准差均明显低于手工分离组(3.4vs.15.3;5.1vs.10.3)。结论:相比传统的羟乙基淀粉手工分离法,干细胞分离仪脐血分离浓缩效果理想,且结果标准误小,数据稳定。

间充质干细胞移植修复炎性肠组织过程中的主导基因筛选

背景:前期研究已证明间充质干细胞可定植于炎症性肠黏膜修复炎症性肠组织。目的:应用表达谱芯片技术研究间充质干细胞移植修复前后大鼠炎症性大肠组织的差异基因表达情况,初步揭示与间充质干细胞定植、分化、修复炎症性肠组织过程相关的主导基因。方法:健康SD大鼠随机分为2组:移植实验组用三硝基苯磺酸灌肠制作炎症性肠病模型,造模后24 h经尾静脉注入绿色荧光蛋白标记的间充质干细胞;对照组以生理盐水代替三硝基苯磺酸同法灌肠处理。于移植后28 d取移植实验组和对照组大肠组织,利用基因芯片技术筛选移植实验组和对照组的差异表达基因。结果与结论:对照组和移植实验组大肠组织全基因组表达谱芯片结果有差异性表达的基因共388个(P<0.05,FC>2),其中表达上调基因191个、表达下调基因197个,主要与炎症反应、免疫反应和细胞分化3个方面有关。前10位显著上调和下调的差异基因(共20条)中,与炎症反应相关的有3个,与免疫反应相关的有3个,与干细胞分化相关的有2个。388个差异基因主要涉及33条信号通路(P<0.05),其中与炎症反应相关的有6条,与免疫反应相关的有8条,与干细胞分化相关的有5条。结果可见利用全基因组表达谱基因芯片的方法初步筛选了间充质干细胞修复炎症性肠组织的主要相关基因。

左旋精氨酸恢复eNOS和iNOS平衡并抑制肺动脉高压的研究

目的探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在中、晚期肺动脉高压（PH）发病中的作用机制及左旋精氨酸（L—Arg）对其产生的影响。方法30只雄性sD大鼠随机均分为5组，对照组（C组）、MCT3组（M3组）、MCT5组（M5组）、L—Arg3／MCT3组（L3组）、L-Arg5／MCT5组（L5组）。除C组外其他组大鼠均用野百合碱一次性腹腔注射诱导PH模型。此后L3组和L5组分别连续每天腹腔注射L—Arg3周和5周，M3组和M5组分别连续每天腹腔注射与L—Arg等量的生理盐水3周和5周，C组连续每天腹腔注射与L—Arg等量的生理盐水共5周。实验周期结束则用右心导管法测定右心室收缩压（RVSP），间接反映肺动脉压力，然后取大鼠肺组织做免疫组化，检测各组iNOS、内皮一氧化氮合酶（eNOS）和弹性蛋白（elastin）的表达变化。结果M3和M5组中iNOS和elastin的表达明显高于C组，而eNOS表达明显少于C组；L3和L5组iNOS和elastin的表达少于相应M3和M5组，但L5组两种蛋白表达仍高于C组，L3和L5组eNOS的减少明显比相应M3和M5组少，但不及C组。结论PH形成的中、晚期，肺组织中eNOS表达减少，而此时iNOS的表达增高可能产生大量一氧化氮（NO），但并没有改善PH的病情，而L-Arg能够恢复eNOS和iNOS之间的平衡并有效抑制PH的进展。

肿瘤干细胞标志物CD166在大肠癌的表达及其临床意义

目的检测肿瘤干细胞标志CD166在大肠癌中的表达，以了解其在大肠癌发病中的意义。方法用RT—PCR检测23例大肠癌患者的癌组织和癌外正常大肠组织中的CD166 mRNA的阳性率和表达水平，并分析其与临床和病理各变量的相关性。结果大肠癌组织CD166 mRNA表达的阳性率为95．7％，表达水平为0．309±0．145，均显著高于正常大肠组织的39．1％和0．109±0．255（P〈0．01），其表达率与表达强度与患者的年龄、性别、临床分期、肿瘤部位、肿瘤大小、病理分型等均无显著关系（P〉0．05）。结论肿瘤干细胞标志物CD166在大肠癌中高表达，其表达与临床和病理的特征无显著关系。

应用Gateway技术构建过表达β-catenin基因的慢病毒载体

目的应用Gateway技术构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体，验证该载体的功能。方法利用多位点Gateway克隆技术，通过BP重组反应，构建穿梭载体pDown—Ctnnb1；再通过LR重组反应，将pUp—EF1A、pDown—Ctnnb1、pTail-IRES／DsRed—Express2和母载体pLV．Des3d．P／puro4个质粒构建成表达载体pLV．EX3d．P／puro—EF1A〉Ctnnb1〉IRES／DsRed-Express2；再转化到感受态细胞stbl3，经PCR筛选菌落阳性克隆测序鉴定。将成功构建的慢病毒表达载体转染293T细胞，用实时荧光定量PCR法验证重组载体对β—catenin基因mRNA水平的影响。结果菌落PCR筛选和DNA测序鉴定显示入门克隆和表达载体插入片段序列正确，实时荧光定量PCR证实β-catenin基因mRNA水平显著上调（P〈0．01）。结论成功构建能显著上调β-catenin基因mRNA表达的慢病毒载体。