溺死相关硅藻rbcL基因检测技术研究

目的:筛选硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase,rbc L)基因的特异性引物,建立溺死尸体组织内硅藻rbc L基因的聚合酶链式反应-毛细管电泳(polymerase chain reactioncapillary electrophoresis,PCR-CE)检测方法,探讨在溺死诊断中的应用价值。方法:采用荧光标记引物扩增硅藻rbc L基因,对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA扩增产物进行PCR-CE检测,验证引物特异性和灵敏度。检测溺死尸体组织样本中硅藻,并比对微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法(microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM)检测结果。结果:使用引物ND-rbc L对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA进行扩增,其中舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻和骨条藻6种硅藻的CE检测结果为阳性,DNA片段为197 bp,其他为阴性。6种硅藻DNA检测阳性的灵敏度分别为0.502、0.117、0.029、0.042、0.275和0.215 ng(20μL扩增体系)。PCR-CE方法检测35例尸体(3例陆地正常死亡尸体,2例水中发现非溺死尸体,30例溺死尸体)的组织样本,肺脏、肝脏和肾脏硅藻检出率分别为100%、63.3%和53.3%,检测总阳性率为83.3%。当溺水死亡尸体脏器组织内硅藻含量>10个/10 g时,使用MD-VF-Auto SEM方法检测,其检测总阳性率为100%,PCR-CE方法检测,其检测总阳性率为92.6%,两者对检测溺死尸体脏器中硅藻阳性率无统计学差异(χ2=2.077,P=0.491);当硅藻含量<10个/10 g时,PCR-CE方法检测为阴性,与MD-VF-Auto SEM方法检测溺死尸体各种脏器中硅藻阳性率具有统计学差异(P<0.05)。结论:基于ND-rbc L引物建立的PCR-CE法能快速检测硅藻rbc L基因,所需检材量小,易于推广,在溺死诊断中有较好地应用前景。

珠江广州段浮游真核微生物分布及其法医学意义

通过对珠江水域(广州段)水样进行18S rDNA测序分析,探究同一水域不同地点的硅藻及其他浮游真核微生物的分布和差异,以期为溺死诊断和溺水地点的推断提供参考依据。在珠江水域(广州段)随机等距离选取4个取水点采集水样,采用18S rDNA测序对各取水点的硅藻及其他浮游真核微生物进行定性和定量分析。珠江不同取水点包括硅藻在内的浮游真核微生物的种类数量(OTU数)平均为483.73±39.06个,但不同取水点中的数量具有显著差异。同时,不同取水点的微型浮游生物组成比例也存在显著差异。取水点W1与W4中存在特异的硅藻属:W1为脆杆藻属;W4为圆筛藻属、细柱藻属和泥生藻属。种水平上的分析显示,所有取水点均具有特异物种,而以W4中为最多,达98种。珠江水域(广州段)不同地点的浮游真核微生物群落分布及其差异可为死因和溺水地点的推断提供参考,并可用于建立珠江水域的浮游真核微生物数据库。同时,珠江水域不同地点存在的特异物种,也可为溺水地点的推断提供新指向。

基于qPCR检测方法的溺死诊断研究

目的针对水体中常见的硅藻、蓝藻和气单胞菌,设计相应引物,采用qPCR方法进行检测,验证该方法的特异性和检测灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计与溺死相关的浮游生物特异引物ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD;扩增20种浮游生物标准株DNA以确定其特异性和灵敏度;检测38只实验兔的肺、肝、肾组织的样本,计算设计的6对引物扩增产物的总体检测阳性率,并与相应的硅藻电镜检验结果对比,验证所建立方法诊断溺死的有效性。结果ND、UPA两对引物能特异扩增硅藻属,CBR能特异扩增蓝藻属,AER、HLYA、rPOD能特异扩增气单胞菌属;以上6对引物扩增产物均能达到0.0001ng的检测灵敏度。实验兔的qPCR检测结果显示,16只溺死兔肺组织均为阳性,且分别有13例肝和14例肾呈阳性,总体诊断阳性14例,阳性率可达87.50%;16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织检出阳性,其余皆为阴性。电镜结果显示,16只溺死兔的肺、肝、肾均为阳性,16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织电镜检出硅藻阳性,其余皆为阴性,与qPCR结果相一致;经统计学分析,上述两种方法对38只实验兔的总体诊断结果差异没有统计学意义(P=0.49>0.05),对38只实验兔的所有肺、肝、肾样本检测的诊断阳性率差异没有统计学意义(P=0.29>0.05)。结论上述6对引物结合qPCR检测方法进行溺死诊断,具有较高的灵敏度,且特异性较好,具有良好的应用前景。

检测藻类16SrDNA特异性片段在溺死诊断中的应用

目的建立藻类16Sr DNA特异性片段扩增方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法 35只实验兔随机分组:生前入水组(溺死组)15只,死后入水组(空气栓塞致死后入水)15只,对照组(空气栓塞死后不作处理)5只;微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的20例水中尸体肝脏样本20份(硅藻阳性14份,阴性6份)。7种已知藻(直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻,铜绿微囊藻,小环藻,小球藻)作为对照。提取组织样本及藻类DNA,扩增产物银染显带。结果生前入水组肺、肝、肾检出率分别为100%,86%,86%;死后入水组肺、肝、肾检出率分别为13%,0%,0%。对照组肺、肝、肾藻类未检出。生前入水组与死后入水组各种脏器中藻类检出率差异显著(P<0.05)。20份经微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测的水中尸体肝脏样本中,使用本方法15份样本结果为阳性(包括1份硅藻阴性样本)。7种藻类DNA扩增结果为阳性。结论本文所建立的PCR法检测藻类16Sr DNA灵敏度高,可对多种溺死藻类同时检测,有较好的应用前景。

PCR毛细管电泳法检测嗜水气单胞菌gyrB和16SrRNA基因：溺死诊断方法

目的建立嗜水气单胞菌gyr B和16SrRNA基因PCR毛细管电泳检测方法,探讨它们在淡水溺死诊断中的应用价值。方法提取人、18种浮游生物(白色念珠菌、嗜水气单胞菌及16种藻类),以及经微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的30例尸体(其中生前淡水溺死28例,陆地自然死亡2例)的组织样本的DNA(肺、肝、肾各1份/例),分别使用引物AH(gyr B基因)及引物Ah(16SrRNA基因)进行扩增,扩增产物用毛细管电泳法检测。结果人、白色念珠菌、16种藻类DNA扩增后毛细管电泳检测结果均为阴性,而嗜水气单胞菌结果均为阳性,其产物大小分别为195 bp,350 bp。分别利用引物AH和Ah对28例淡水溺死尸体样本肺、肝、肾进行PCR毛细管法进行检测,嗜水气单胞菌的检出率:AH分别为96.4%,71.4%,60.7%;Ah分别为75.0%,42.9%,32.1%,计算得到溺死者的体循环脏器中嗜水气单胞菌检验的总阳性率分别为82.1%,53.6%,2例陆地自然死亡案件尸体样本检测结果均为阴性。两对引物AH与Ah对嗜水气单胞菌检出率有显著性差异(P<0.05)。结论 PCR毛细管电泳法检测嗜水气单胞菌gyr B基因用于诊断淡水溺死灵敏度较高,可作为诊断的辅助性方法;联用16SrRNA基因可提高该菌的检出率,增强MDVF-Auto SEM法诊断淡水溺死的证据力。

气单胞菌aerA和hlyA两基因在溺死诊断中的应用

目的建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素(aerA)和溶血素(hlyA)两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计气单胞菌(Aeromonas)特异性引物aer-A1和hlyA-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株DNA;确定最低DNA检测浓度;检测16只实验猪和40例真实案件尸体组织样本,分别计算两对引物总阳性率。结果引物aerA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180bp,灵敏度分别为0.034、0.92ng;引物hlyA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,产物片段为150bp,灵敏度分别为0.94、0.034ng。利用aerA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为70.00%、78.38%;利用hlyA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为80.00%、83.78%。结论基于气单胞菌aerA基因和hlyA基因建立的PCR-CE检测方法进行溺死诊断,快速灵敏,特异性好,有良好的应用前景。

广州3个人工湖真核浮游生物分布及其法医学意义

目的通过对广州人工湖水域夏冬两季水样进行18S rDNA测序分析,寻找不同人工湖的硅藻及其他真核浮游生物分布和差异,从而为溺死诊断和落水地点的推断提供依据。方法在3个人工湖(白云湖、东山湖和海珠湖)中各选取等距离的3个取水点,分别在夏冬两季采集水样,采用18S rDNA测序对各取水点的硅藻及其他真核浮游生物进行定性和定量分析。结果夏冬两季各人工湖中包括硅藻在内的真核浮游生物的种类数量具有显著差异,分别为477.22±25.12个和284.48±13.79个。而不同人工湖之间的硅藻含量具有显著的时空分布差异。此外,各人工湖硅藻的种类和数量不完全相同,其中白云湖特有硅藻种属为Fistulifera属、拟菱形藻属、肘杆藻属和Roundia属,而东山湖特有种属包括双眉藻属、异极藻属和布纹藻属,海珠湖仅为脆杆藻属。结论对于水中尸体的法医学分析,不同人工湖的真核浮游生物群落分布及其差异可为下一步建立水中真核浮游生物种群的背景数据库积累基础数据,进而为死因和溺死地点的推断提供参考。

实时荧光定量PCR检测硅藻UPA基因在溺死诊断中的研究

目的建立硅藻UPA条形码基因的实时荧光定量PCR检测方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法对Gene Bank中登录的硅藻UPA基因序列进行比对获得同源序列,据其设计硅藻门通用引物。对2种人体常见共生菌(大肠杆菌、双歧杆菌)、3种浮游细菌、15种浮游藻类、32具尸体(其中生前溺水死亡28例,死后抛尸1例,陆地死亡3例)的组织样本(肺、肝、肾)及尸体发现地水样提取DNA,采用设计的引物进行特异性、灵敏度、重复性试验,分析检材中硅藻检出情况,统计硅藻阳性率,以上述组织样本的微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法检测结果对建立的q PCR检测方法进行比较评估,比较该方法与PCR-毛细管电泳检测法的灵敏度。结果引物UPA99仅对硅藻标准株(针杆藻、舟形藻、直链藻、小环藻、菱形藻)DNA具有扩增,扩增产物熔解曲线平稳,峰尖且窄,熔解温度为(87±1)℃。以p MD18-T重组质粒为标准品,检测区间为1.56×10~2-1.56×10^(-5)ng/μL,建立实时q PCR方法的灵敏度为1.56×10^(-5)ng/μL,而PCR-CE方法的灵敏度为1.56×10-3ng/μL。批间及批内变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。对于生前溺水尸体肺、肝、肾的检出率依次为89.3%,71.4%,64.3%。结论基于硅藻UPA基因设计通用引物,建立的q PCR硅藻检验法特异性高、灵敏度高、重复性好,应用于溺死诊断具有较好的应用前景。

PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用

目的采用PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因,评估其在溺死鉴定中的应用价值。方法 60只实验兔随机分为生前溺死(水中溺毙)、死后入水(空气栓塞致死后入水)、对照组(空气栓塞致死后不做处理);溺死人体脏器组织;取各组织检材提取硅藻DNA,PCR扩增硅藻特异的核糖体小亚基(SSU)片段,用琼脂糖凝胶电泳检测、DHPLC检测分析。结果 6份硝酸消化法检测阴性的溺死人体器官组织检材经PCR及琼脂糖凝胶电泳检出5例阳性。生前溺死组肺、肝、肾硅藻检出率分别为100%、90%、85%,死后入水组仅肺检出硅藻(15%),对照组各组织均为阴性;生前溺死组检出率明显高于死后入水组(P<0.05)。10份溺死人体器官组织检材采用DHPLC法检出硅藻种类明显多于微波消解-扫描电镜法(P<0.05)。脏器检出硅藻种类与溺死点水样一致。结论采用PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因,有助于溺死鉴定和溺死地点的推断,具有法医学应用价值。

溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系

目的构建溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系,验证体系特异性并评估其在法医溺死诊断中的应用价值。方法针对溺死相关浮游生物同源基因序列,设计特异性引物,并用FAM、HEX、TAMRA、ROX、SIZ荧光染料分组标记,构建复合扩增体系;进行体系特异性验证;以16例实验猪样本评估体系检验效能;复合扩增体系、硅藻形态学MD-VF-Auto SEM检测法及硅藻rbc L基因PCR-CE检测法分别检测28例案件样本,比较分析应用效果。结果该复合扩增体系共包含14个基因座,可特异性扩增35种浮游藻类和3种浮游细菌,人、3种人体共生菌及8种浮游细菌均为阴性。以该体系检测溺死实验猪,阳性率为90%,非溺死实验猪均未检出;检测溺死案件样本,阳性率为96%,非溺死案件均未检出。复合扩增体系与MD-VF-Auto SEM法检测案件尸体肺、肝和肾的阳性率均不具有统计学差异(P>0.05),但其与硅藻rbcL基因PCR-CE法检测案件肝和肾的阳性率均具有统计学差异(P<0.05)。结论本文针对多种溺死相关浮游生物14个基因建立的复合扩增体系,具备多种靶物种的特异性遗传标记,且所需检材量小,提高了检测效能,在法医溺死鉴定中具有良好的应用前景。