昆虫保幼激素的生殖调控机制研究进展

保幼激素(Juvenile hormone, JH)是昆虫特有的一类倍半萜烯类激素。JH在幼/若虫中主要通过拮抗蜕皮激素20E信号影响变态发育,从而维持昆虫幼虫性状。JH在成虫中作为促性腺激素,通过调控雌雄一系列生理和行为促进生殖。JH信号调控雌性生殖主要包括促进卵巢卵子发生、卵黄发生、排卵、滞育、雌性性信息素合成、肠道和卵巢等器官的大小适应性调整等。JH信号促进雄性生殖,主要包括促进附性腺精液蛋白的合成、羽化后调节雄性性行为,进而促进生殖。本文从雌雄性昆虫角度分别阐述JH信号调控生殖的机制,以期为深入探明JH调控昆虫生殖的作用机制提供参考。

novel-m0287-3p调控斜纹夜蛾中肠蜕皮激素受体的表达

microRNA(miRNA)是一类长度约为23个核苷酸的非编码内源性小分子RNA,参与真核生物基因表达的调控,从而在生物发育和应对环境中起着重要的作用。为了探讨novel miRNA在害虫发育中的作用,本研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura miRNA数据库中表达量较高的novel-m0287-3p进行了研究。通过生物信息学分析,确定了novel-m0287-3p是一个新的miRNA,并预测其可能靶向蜕皮激素受体EcRb1,表明novel-m0287-3p可能参与斜纹夜蛾发育的调控。双荧光素酶实验表明,novel-m0287-3p分别结合于EcRb13′非编码区的2个位点上。实时荧光PCR结果显示novel-m0287-3p和EcRb1均在斜纹夜蛾的中肠中表达。为了进一步揭示novel-m0287-3p对EcRb1表达的调控以及对幼虫发育的影响,本研究进行了体内实验。将novel-m0287-3p的模拟体类似物注射入斜纹夜蛾幼虫,结果显示斜纹夜蛾体内EcRb1的mRNA水平发生了下调,证明novel-m0287-3p能够抑制幼虫EcRb1的表达。向4龄第1天的斜纹夜蛾幼虫注射novel-m0287-3p后,幼虫的生长受到抑制;而注射斜纹夜蛾6龄幼虫则导致其化蛹滞后。研究结果表明,novel-m0287-3p可通过调控蜕皮激素受体EcRb1的表达,从而影响斜纹夜蛾的生长发育。

SCP-2基因的表达调控研究进展

固醇转运蛋白(SCP-2)是广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中的非特异性脂转运蛋白.任何影响固醇转运蛋白基因表达的因素都会影响甾类激素的合成,进而影响生物体的发育.目前对该基因的转录调控研究较少,主要集中在哺乳动物.环境、激素、转录因子等对SCP-2基因的表达调控均有影响,对SCP-2基因作为害虫防治靶标的可能性进行了初步的探讨.C/EBP蛋白作为调控Sl SCPx基因表达的转录因子,可以调控Sl SCPx基因的表达.推测了C/EBP蛋白成为新的害虫防治的靶标的可能.

斜纹夜蛾酵母双杂交文库的构建及其在蜕皮激素受体互作蛋白筛选中的应用

【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）和超气门蛋白（ultraspiracle protein,USP）〕结合,启动20E诱导的级联反应。本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理。【方法】以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白。【结果】文库转化效率达到3.0×106cfu/μg,文库滴度达到1.3×108cfu/m L,文库插入片段大小在500~2 000 bp之间。4种诱饵质粒（EcRA/p GBKT7,EcRB1/p GBKT7,USP1/p GBKT7和USP2/p GBKT7）对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠。用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白。随后,从中挑选了Dna J-5（Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣）,MBF2（mediator of Bm FTZ-F1 type 2,一种转录共激活子）,polyubiquitin（多聚泛素类蛋白）,esr16（ecdysteroid regulated 16k Da protein,一种蜕皮激素调控蛋白）和NEDD8-like（neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白）5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系。【结论】分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用。本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。

DNA甲基转移酶参与调控斜纹夜蛾和家蚕幼虫的生长

DNA甲基化是真核生物生长发育过程中基因表达的一种重要调控机制。本研究以鳞翅目农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和模式昆虫家蚕Bombyx mori为材料,研究了甲基化对幼虫生长的影响。研究结果表明,注射甲基化抑制剂5-Aza-d C后,不正常斜纹夜蛾比对照增加了36%,家蚕的增加了58.8%,不正常虫的生长发育缓慢、体型变小。斜纹夜蛾DNA甲基转移酶Sldnmt1 RNAi获得了相似的结果,不正常幼虫率比对照增加了35%。检测家蚕Bmdnmt1的m RNA水平,发现Bmdnmt1在5龄期的翅原基、脂肪体、表皮和中肠均有表达,其表达量在翅原基中的为最高;在翅原基和脂肪体中,Bmdnmt1的含量在5龄初期比在预蛹期的要高。初步分析了甲基化抑制剂处理后的家蚕脂肪代谢相关基因的表达,发现脂肪酶和乙酰辅酶A结合蛋白的m RNA水平在注射5-Aza-d C后48 h显著下调。研究结果初步表明了DNA甲基化参与调控了鳞翅目幼虫的生长发育,脂肪代谢可能是DNA甲基化调控的其中一个通路。

整联蛋白在家蚕翅发育中的作用研究

昆虫翅在昆虫生命活动中起着十分重要的作用,将昆虫的活动范围从平面扩大到立体,使其在躲避敌害、觅食和繁衍等方面增强了竞争优势。对家蚕翅突变表型的研究能够分析翅发育过程中基因调控的分子机制。本研究以家蚕泡状翅突变体w13为材料,分析了整联蛋白在翅原基中的表达和分布。qRT-PCR结果显示,整联蛋白基因家族在野生型和w13突变型翅原基中有着显著的差异表达。对其中差异表达的整联蛋白基因Bmintegrinβ3进行克隆、原核表达并制备了多克隆抗体。免疫组化分析结果显示,整联蛋白Bm INTEGRINβ3在w13突变型翅原基中的表达量极低。在c108野生型中Bm INTEGRINβ3呈微丝状,将翅的背腹侧表皮联系在一起,但在w13突变型中未检测到该蛋白。推测Bm INTEGRINβ3的下降或缺失可能是导致翅背腹表皮间的维系不紧密并形成泡状翅的原因之一。本研究为解释整联蛋白在昆虫翅发育中的功能作用提供了线索。

miR-305-3p和miR-71-5p通过调控谷胱甘肽代谢途径参与斜纹夜蛾应对植物次生物质

昆虫和植物在长期进化过程中形成相互作用的关系。其中植物次生物质是植物防御昆虫的主要机制,而昆虫则以解毒酶来应对。为了发现可用于害虫防治的miRNA,通过对农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura进食芥菜Brassica juncea后中肠的测序分析,获得了一系列差异表达的miRNA。通过生物信息学分析,发现斜纹夜蛾miR-305-3p靶向了谷胱甘肽代谢中的谷氨酸半胱氨酸连接酶的催化亚基(Slgclc),这是一个谷胱甘肽从头合成的限速酶;而miR-71-5p靶向调控gclc和解毒酶表达的转录因子SlNrf2。用芥菜的次生物质吲哚-3-甲醇处理斜纹夜蛾Spli-221细胞株后,实时荧光定量PCR证明Slgclc和SlNrf2表达上调,miR-305-3p和miR-71-5p表达下调。分别在斜纹夜蛾Spli-221细胞中超表达miR-305-3p及miR-71-5p mimics,Slgclc或SlNrf2转录水平下调,并且miR-71-5p mimic处理抑制了SlNrf2下游基因Slgclc和解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的表达。结果表明:miR-305-3p和miR-71-5p响应植物次生物质而分别促进Slgclc和SlNrf2表达。然而双荧光素酶实验显示miR-305-3p并不与Slgclc直接结合,miR-71-5p也不与SlNrf2直接结合,推测miR-305-3p和miR-71-5p可能间接调控Slgclc和SlNrf2的表达。研究结果表明,斜纹夜蛾miR-305-3p和miR-71-5p通过调控解毒酶GSTs表达及其底物谷胱甘肽的生成,而参与昆虫抵抗植物次生物质。

斜纹夜蛾精巢的发育和精子的发生

采用解剖观察、石蜡组织切片及苏木精-曙红染色方法,利用显微镜照相获取图像,研究了斜纹夜蛾幼虫到成虫精巢的发育及精子的发生.研究结果表明:2个精巢在预蛹期开始融合,并在蛹期融合成1个;在成虫期,随着精子的排出,精巢体积逐渐减小;斜纹夜蛾雄性生殖细胞发育为有核精子和无核精子,2种精子的发生都经过精原细胞囊期、精母细胞囊期和精细胞囊期;精子的形成主要区别在于有核精子的细胞核有一个变形过程,而无核精子形成过程中不经过细胞核变形,且后期将细胞核丢弃.综上所述,有核精子的主要发育时期为6龄到蛹期,而无核精子的主要发育在蛹期.本研究结果可为进一步研究和控制精子形成以及利用生殖机理防治斜纹夜蛾打下基础.

Sli-miR-34-5p响应植物次生物质正调控斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因SlGSTe1的表达

【目的】昆虫解毒酶系统是昆虫适应植物次生物质的主要机制,研究调控解毒酶基因表达的mi RNA将发现可用于害虫防治的靶标分子。本研究旨在探究Sli-miR-34-5p对斜纹夜蛾Spodopteralitura中应对植物次生物质的解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的调控作用。【方法】通过实时荧光定量PCR检测Sli-miR-34-5p在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫进食芥菜Brassica juncea后中肠中的表达;在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫体内及细胞株中超表达Sli-miR-34-5p模拟体类似物(mimics)或抑制剂(inhibitors),采用实时荧光定量PCR和Western blot分析Sli-miR-34-5p已知或推测的靶基因的表达变化;利用双荧光素酶报告系统验证Sli-miR-34-5p对靶标基因的表达调控作用;采用生物信息学方法预测Sli-miR-34-5p可能的靶基因,以了解其可能的作用机理。【结果】结果表明,Sli-mi R-34-5p在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫进食芥菜24和48 h时的中肠中表达显著上调。在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫血淋巴中超表达Sli-miR-34-5p mimic,进食芥菜的斜纹夜蛾中SlGSTe1转录上调;反之,超表达Sli-miR-34-5p inhibitor,SlGSTE1蛋白水平显著下调。在斜纹夜蛾Spli-221细胞株中添加芥菜次生物质吲哚-3-甲醇(I3C),Sli-miR-34-5p和SlGSTe1的表达量均呈现上调的趋势;此外,在细胞中转染Sli-miR-34-5p mimic,SlGSTe1的表达水平明显上调。然而,生物信息学预测和双荧光素酶报告系统检测结果显示,Sli-miR-34-5p并不直接作用于靶基因Sl GSTe1。【结论】研究结果提示Sli-miR-34-5p通过促进斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因Sl GSTe1的表达而参与斜纹夜蛾应对植物次生物质的胁迫。

家蚕Bmlark基因启动子活性及转录调控元件分析

LARK蛋白是一个参与多个发育途径的重要调控转录因子。为研究家蚕Bmlark基因启动子活性及其调控蛋白,本研究克隆了家蚕Bmlark基因的启动子序列(-1232~+211),构建了该启动子萤光素酶报告质粒,转染至家蚕Bm12细胞中,进行启动子萤光素酶活性检测。结果表明,Bmlark基因的-124~-92 bp和-220~-124 bp区域参与了其转录调控。利用-124~-92 bp区域的DNA片段作为分子探针,发现该区域可能与蛋白TAF7,Ets transcription factor,protein abrupt isoform X1和forkhead box protein N3等结合。研究结果为进一步深入研究Bmlark转录调控的分子机制提供了线索。

肠道菌群影响昆虫生殖的研究进展

昆虫肠道菌群已被当作一个特殊的“多功能器官”,并作为个体的重要组成部分在昆虫生长发育、营养、免疫及抵御病原物等方面发挥着重要作用。肠道微生物不仅影响肠道的健康与功能,还通过其代谢产物影响生殖器官发育与生殖行为。本文主要总结了近年来肠道菌群影响昆虫生殖的主要研究结果和进展,为未来通过改变肠道菌群开展资源昆虫的大量生产与利用以及害虫的生物防治提供参考。

细胞自噬介导的动物脂代谢及其检测

细胞自噬(autophagy)是从酵母到哺乳动物都高度保守的、降解胞内物质的过程,受到能量和营养等信号的严格调控。已有研究表明,哺乳动物中高脂饮食可诱导肝脏内自噬的发生,某些自噬相关基因(autophagy related genes,Atg)敲除后阻碍肝脏细胞的脂代谢,并导致脂滴堆积,形成脂肪肝。昆虫中的现有研究也暗示细胞自噬与昆虫脂肪体的代谢密切相关。目前为止,细胞自噬调控脂代谢的研究还有许多不明之处。除已报道的ATG蛋白外是否其他ATG蛋白也参与脂代谢尚无报道;已知的参与脂代谢的ATG蛋白分子作用模式不清楚;溶酶体中哪些酶参与了自噬介导的脂代谢也未被证实。ATG蛋白差异参与真菌和高等动物的脂滴形成与脂肪降解,但具体机制不详,昆虫的进化地位介于高等动物和真菌之间,昆虫中开展自噬介导脂代谢的研究对于解析高等动物的疾病诸如肥胖症、高血脂症,及以昆虫脂肪体代谢发育为调控靶标的工作具有重要意义。为此,本文对主要在哺乳动物中获得的自噬介导脂代谢的研究进展进行综述,并对脂代谢的一些研究方法和检测技术进行了总结,以期为昆虫乃至其他生物的相关研究提供借鉴与参考。

家蚕翅原基细胞的凋亡和自噬分析

【目的】家蚕Bombyx mori翅原基在生长分化过程中伴随着造血器官和翅囊等组织的消失。本研究旨在分析家蚕翅原基生长分化过程中是否存在细胞凋亡和细胞自噬。【方法】制作蛹期0 d翅原基石蜡切片,利用TUNEL法检测细胞凋亡情况;提取5龄第3天、5龄第6天、上簇第1天、预蛹期、蛹期0 d及蛹期第3天的翅原基总RNA,反转录成c DNA,利用定量PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达水平;检测了细胞凋亡相关的Caspase 3和细胞自噬相关的酸性磷酸酶活性。【结果】TUNEL染色发现蛹期0 d的翅原基出现部分细胞凋亡现象;细胞凋亡相关基因Caspase 3和Nc主要在5龄幼虫期有高水平表达,细胞凋亡抑制因子IAP主要在幼虫末期有较高水平的表达;Caspase 3酶活性在上簇第1天出现峰值;细胞自噬相关基因Atg5,Atg6,Atg8和Atg12主要在幼虫末期有较高水平的表达;酸性磷酸酶活性也主要在幼虫末期较高。【结论】在幼虫期可能存在细胞凋亡,抑制了翅原基细胞的增殖,进而阻止了翅原基的生长分化;在幼虫末期可能同时存在细胞凋亡和自噬,促进翅囊等的退化,同时阻止了翅原基细胞的增殖,推动了翅原基向蛹翅的发育。

保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响

文中以家蚕翅原基为材料,通过制做离体石蜡切片的方法观察了翅原基从五龄幼虫第3天至蛹期0天的形态变化,并通过注射外源蜕皮激素活性物质20E和保幼激素类似物Methoprene探究了昆虫激素对家蚕翅原基生长分化的影响.结果显示,翅原基在幼虫阶段发育缓慢,从五龄幼虫第6天起生长分化逐渐加快,且翅原基的形态发生了显著变化,原本附着于翅原基腔口处且呈团状的造血器官逐渐分散至消失,而由气管组成的翅脉逐渐形成.外源激素处理结果显示,2μg的20E可促进翅原基的生长分化,而2μg的Methoprene抑制了翅原基的生长分化.上述结果说明蜕皮激素和保幼激素共同调控了翅原基的生长分化,并最终实现了翅原基的变态发育.

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。

斜纹夜蛾视黄酸结合蛋白(Slcrabp)基因的克隆、表达及功能

视黄酸结合蛋白(Cellular retinoic acid binding protein,CRABP)属于胞内脂质结合蛋白超基因家族,参与了许多生理活动,如细胞分化、组织重建和信号转导等,但其在昆虫中肠的作用尚不明确。研究从斜纹夜蛾Spodoptera litura中肠基因表达序列标签(EST)文库中克隆获得一个编码Slcrabp的全长c DNA,该c DNA由396个核苷酸组成,编码132个氨基酸。预测CRABP蛋白质的空间结构与脂肪酸结合蛋白非常相似,含一个由10个反平行的β折叠和2个α螺旋形成的配体结合中心结构域。Sl CRABP基因具有4个外显子,与脊椎动物crabp基因类似。RT-PCR检测表明,在转录水平上,Slcrabp在6龄幼虫中肠的各个时期均有较高表达。Western blot分析结果显示,Sl CRABP蛋白分布广泛,在中肠、脂肪体、精巢等组织上大量表达。在中肠,其表达峰值出现在预蛹期。利用荧光标记物质8-苯胺基-1-萘磺酸(1,8-ANS)分析了重组Sl CRABP蛋白与不同底物的亲和力,发现Sl CRABP与不饱和长链脂肪酸有较高结合活性,如花生四烯酸钠、亚麻酸、油酸钠和油酸,但与视黄酸、视黄醇的结合力却很弱或几乎不结合,暗示斜纹夜蛾Sl CRABP功能与同家族脂肪酸结合蛋白(FABP)性质相似。对6龄幼虫进行饥饿处理,结果显示经过经24 h和48 h饥饿处理后,虫体中肠Sl CRABP蛋白质的表达量有显著上升,暗示Sl CRABP可能参与了斜纹夜蛾体内脂类的转运过程。

家蚕表皮型几丁质合成酶基因BmCHSA-2a的鉴定及其对激素的响应

文中采用5'Race方法获得了家蚕几丁质合成酶基因(BmCHSA-2a)的第1外显子(Exon 1,141 bp)和第2外显子(Exon 2a,106 bp),证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守.根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素的响应,结果表明:蜕皮激素(Ecdysone,20E)抑制BmCHSA-2a的表达;保幼激素(Juvenile Hormone,JH)间接促进其表达.根据家蚕基因组所预测的启动子序列,扩增了调控BmCHSA-2a表达的启动子,证明蜕皮激素抑制启动子活性,并存在大量蜕皮激素通路BmFTZ-F1的调控元件.对BmFTZ-F1表达调控的进一步研究表明:蜕皮激素抑制其表达.研究结果初步分析了家蚕表皮几丁质合成酶基因BmCHSA-2a可能的表达机制,为深入研究其表达调控机理及发现害虫防治新靶标提供了理论基础.

家蚕保幼激素信号途径中转录因子BmKr-h1的基因克隆与表达分析

Krüppel homolog 1(Kr-h1)是含有C2H2锌指结构的转录因子,在昆虫变态发育中起重要作用。从家蚕5龄第3天幼虫的表皮中克隆了Bm Kr-h1基因,该基因全长c DNA为1 918 bp,其中开放阅读框1 047 bp,GC含量42.2%,编码348个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现大部分昆虫物种的Kr-h1都含有8个锌指结构,暗示该蛋白质的功能具有一定的保守性。通过生物信息学方法预测Bm Kr-h1不含信号肽和糖基化位点,但含有19个可能的磷酸化位点,暗示其活性可能受到磷酸化和去磷酸化修饰的影响。利用原核表达系统表达获得了可溶的Bm Kr-h1蛋白并制备了抗体。Western blot和半定量RT-PCR检测的结果显示,不论在mRNA水平还是蛋白质水平,Bm Kr-h1在家蚕幼虫5龄初期和吐丝期的翅原基都有较高水平表达,而在蛹期的表达量较低。用保幼激素(JH)类似物Methoprene和蜕皮激素(20E)分别注射家蚕5龄第3天幼虫,发现2种激素均能诱导蚕体内Bm Kr-h1的表达上调。免疫组织化学结果显示,Bm Kr-h1在5龄第3天幼虫各组织中的表达量很低,而在吐丝期的中肠、脂肪体和表皮中都有一定水平的表达,暗示其可能参与家蚕蜕皮变态的过程。上述结果表明Bm Kr-h1可以响应JH和20E的诱导,提示其在家蚕的变态发育中发挥作用。

家蚕翅原基表皮蛋白基因BmWCPs的生物信息学分析与激素诱导表达特征

翅原基表皮蛋白（WCPs）在昆虫翅的发育中起着非常重要的作用。为了研究家蚕翅原基表皮蛋白基因BmW CPs的表达是否与蜕皮激素（20E）的调节有关,用生物信息学方法分析BmW CPs基因的序列结构与系统进化特点,并通过半定量RT-PCR检测蜕皮激素对部分BmW CPs基因表达的诱导作用。11个BmW CPs基因成簇分布在家蚕基因组中,除BmW CP6和BmW CP10分别分布在第7号、第21号染色体外,其余的BmW CPs均分布在第22号染色体上;11个BmW CPs的核苷酸序列长度为588～2 670 bp,编码115～312个氨基酸,蛋白质分子质量12～35 kD,等电点4.30～7.45;11个BmW CPs基因的ORF内均有内含子插入,81.82%的基因含有2～3个内含子,内含子长度50～5 958 bp,在50～300 bp之间分布频率最高,占46%。将解剖获取的上蔟1 d蚕体的翅原基进行体外培养,并用浓度为2μmol/L的20E直接处理12 h后再常规培养18 h,提取翅原基总RNA并反转录合成cD NA,经半定量RT-PCR检测样品中BmW CPs的表达水平显著上调。依据上述研究结果初步认为,用蜕皮激素直接处理12 h后再常规培养18 h的脉冲作用,可诱导基因组中成簇分布的BmW CPs在翅原基组织中大量表达,以利于家蚕完成翅原基的变态发育。

hnRNPA1基因在家蚕翅原基组织中的表达与定位分析

核不均一蛋白A1(hnRNPA1)是一个重要的RNA结合蛋白。本研究旨在获得家蚕hnRNPA1基因的cDNA,并对其在家蚕翅原基组织进行表达和定位分析。以家蚕幼虫期翅原基mRNA为模板通过反转录克隆家蚕BmhnRNPA1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。构建pET32a-BmhnRNPA1蛋白表达载体,表达且纯化得到BmhnRNPA1重组蛋白,并制备该蛋白多克隆抗体,通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹翅原基组织中的表达与定位。克隆得到了家蚕hnRNPA1基因的全长cDNA片段,其开放阅读框(ORF)序列为951 bp,编码316个氨基酸,预测分子量为34.98 kDa,等电点为5.15。编码蛋白在第18～90个氨基酸和109～181个氨基酸处为保守的RRM结构域。系统进化分析显示,家蚕hnRNPA1与小菜蛾hnRNPA1的亲缘关系最近。QRT-PCR结果显示,BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹期的翅原基组织中均有表达,且在蛹期第3天的表达量达到峰值。Western blot进一步证实了实验结果。免疫组化分析结果显示,该蛋白存在于翅原基组织中,并定位于细胞核内。家蚕BmhRNPA1具有两个RNA结合结构域,属于hnRNPs家族,定位于细胞核内,表明其可能参与mRNA的选择性剪接作用。本研究结果为进一步探索该基因的功能提供了基础。