3,3′-二吲哚甲烷通过PI3K/AKT/NF-κB通路抑制肝星状细胞的活化

目的观察3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-diindolylmethane,DIM)对乙醇诱导小鼠原代星状细胞激活的抑制作用,并初步探讨其分子作用机制。方法分离6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠肝星状细胞,DIM和乙醇联合处理后,检测星状细胞的活化程度相关的标记蛋白,Western blot检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/核转录因子-κB(NF-κB)通路的激活水平。结果成功分离培养小鼠星状细胞,乙醇单独处理后,能够诱导星状细胞激活,a-SMA表达上调,呈现成纤维细胞的表型,PI3K/AKT/NF-κB通路被激活;DIM单独处理对星状细胞无显著的影响,DIM和乙醇联合处理后,DIM能够显著抑制乙醇诱导的a-SMA的水平,抑制星状细胞的激活,DIM同时抑制了乙醇诱导的PI3K/AKT/NF-κB通路的活化水平。结论DIM对乙醇诱导的星状细胞激活具有一定的抑制作用,其机制可能与抑制乙醇激活的PI3K/AKT/NF-κB通路有关。

3,3'-二吲哚甲烷通过抑制肝细胞的内质网应激改善酒精性脂肪肝的研究

目的观察3,3’-二吲哚甲烷(3,3’-diindolylmethane,DIM)对Lieber-DeCarli标准型(regular型)酒精液体乙醇饲料(LD饲料)诱导的小鼠酒精性脂肪肝的改善作用,并对其分子作用机制进行初步探讨。方法将40只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:正常对照组、酒精组、DIM(50 mg/kg)组和酒精+DIM(50 mg/kg)组,实验结束后称重,处死小鼠,收集血液和肝脏组织,分离血清测定肝功能指标,油红O染色观察肝脏的脂肪蓄积,Western blot检测内质网应激通路蛋白的表达。结果与对照组相比,DIM对肝脏没有显著的影响,四组之间体重无显著变化。与酒精组相比,DIM处理组血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平显著降低(P<0.05),油红O染色和甘油三酯测定显示肝脏甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。DIM明显减轻肝脏脂肪变性,Western blot结果表明DIM能够抑制酒精诱导的内质网通路的关键蛋白PERP、eIF和CHOP的激活作用。结论DIM对小鼠酒精性脂肪肝具有一定的保护作用,其机制可能与抑制酒精激活的内质网应激通路有关。

蛋白磷酸酶2A在氯化镉致小鼠海马神经元细胞tau蛋白过度磷酸化及β淀粉样蛋白沉积中的作用

目的探讨蛋白磷酸酶2A(PP2A)在氯化镉致小鼠海马神经元HT-22细胞tau蛋白过度磷酸化及β淀粉样蛋白(Aβ)沉积中的作用。方法采用不同浓度(0μmol/L、1.25μmol/L、2.50μmol/L、5.00μmol/L、10.00μmol/L、20.00μmol/L)氯化镉对HT-22细胞进行染毒72 h,采用CCK-8法测定细胞活力,以筛选后续实验的染毒浓度。将HT-22细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,分别给予0μmol/L、1.25μmol/L、2.50μmol/L、5.00μmol/L氯化镉染毒,72 h后在倒置显微镜下观察细胞形态,并采用Western blot检测细胞中β淀粉样蛋白前体(APP)、tau蛋白、磷酸化tau蛋白181(Thr181)、PP2A-Aα蛋白、PP2A-Aβ蛋白、PP2A-C蛋白表达水平。结果(1)染毒72 h后,与经0μmol/L氯化镉染毒后的细胞相比,经不同浓度氯化镉染毒后的细胞活力均下降(均P<0.05)。选择细胞存活率为80%左右的氯化镉浓度作为后续实验最高染毒浓度。(2)染毒72 h后,镜下观察发现对照组细胞呈梭形,不同剂量组细胞呈梭形及多边形;与对照组相比,不同剂量组细胞间隙逐渐增宽,且在高剂量组中可见少量漂浮细胞。与对照组相比,低剂量组、中剂量组HT-22细胞的tau蛋白表达水平升高,中剂量组、高剂量组HT-22细胞的Thr181和APP蛋白表达水平升高,各剂量组PP2A-C蛋白表达水平均降低,高剂量组PP2A-Aα、PP2A-Aβ蛋白表达水平下降(均P<0.05)。结论镉可能通过下调PP2A亚基的表达,以诱导小鼠海马神经元细胞tau蛋白过度磷酸化和Aβ生成,进而产生神经毒性。

基于生物信息学的酒精性肝病关键基因筛选及验证

目的利用生物信息学方法探索酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)潜在的关键基因并通过实验验证,为寻找ALD潜在的生物标志物提供依据。方法从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的公共基因芯片数据平台(Gene Expression Omnibus,GEO)的数据库下载两个基因表达谱芯片(GSE28619和GSE100901),利用GEO2R筛选出酒精性肝病实验组与正常对照组的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),对DEGs进行基因本体论(gene ontology,GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路的富集分析,进一步应用STRING数据库构建蛋白质的相互作用网络,用Cytoscape来筛选出关键基因。构建ALD小鼠模型,通过RT-qPCR验证筛选出关键基因。结果总共鉴定出173个DEGs,GO显示DEGs生物学功能主要涉及5个KEGG通路,包括补体和凝血级联、胆固醇代谢、视黄醇代谢、药物代谢-细胞色素P450、胆汁分泌相关信号通路,结合蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)和CytoHubba的结果,筛选出SERPINC1、AHSG、FGG、FGA、ITIH3、FGB、APOB、ALB和APOH 9个关键基因,通过RT-qPCR检测验证,发现与WT小鼠相比,ALD小鼠肝脏ALB、APOB和FGB的mRNA表达上调(P<0.05),而ITIH3、FGG和SERPINC1的mRNA表达下调(P<0.05)。结论ALB、APOB、FGB、ITIH3、FGG、SERPINC1有望成为ALD潜在的生物标志物。

基于生物信息学的非酒精性脂肪性肝病关键基因筛选及实验验证

目的:探索非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)潜在的关键基因和microRNAs(miRNAs)。方法:从美国国立生物技术信息中心(NCBI)公共基因芯片数据平台(GEO)数据库下载两个基因表达谱芯片(GSE96936和GSE62267),利用GEO2R在线工具筛选出NAFLD组与正常对照组的差异表达基因(DEGs),对DEGs进行GO和KEGG信号通路富集分析,进一步应用STRING数据库构建蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)网络,用Cytoscape筛选出关键基因。构建NAFLD小鼠模型,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证筛选出的关键基因,利用NetworkAnalyst构建关键基因的靶向miRNAs。结果:总共鉴定出192个DEGs,GO分析显示DEGs生物学功能主要涉及5个KEGG通路,包括类固醇激素生物合成、补体与凝血级联、胆汁分泌、化学致癌、视黄醇代谢相关信号通路,结合PPI网络和CytoHubba的结果,筛选出Tyrobp、Hck、Ctss、Aif1、Fcgr1、Cd68、Cd53、Ly86、Fyb和Alox5ap 10个关键基因,通过RT-qPCR检测,发现与正常肝组织相比,NAFLD肝组织Ly86的mRNA表达下调(P<0.05),NAFLD肝组织Hck、Ctss、Aif1、Fcgr1、Cd68、Cd53、Alox5ap和Fyb的mRNA表达上调(P<0.05),结合DEGs-miRNAs可视化发现4种miRNAs(mmu-miR-155-5p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-124-3p和mmu-miR-1a-3p)与关键基因链接紧密,预测为NAFLD的关键miRNAs。结论:研究结果将有助于确定NAFLD潜在的生物标志物和治疗的新策略。

3,3'-二吲哚甲烷通过抑制肝巨噬细胞炎症因子表达改善酒精性肝病的机制

目的 观察3,3’-二吲哚甲烷(DIM)对小鼠酒精性肝病的改善作用及对其肝巨噬细胞激活的抑制作用,并初步探讨其分子作用机制。方法 将6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:正常对照组、酒精组、DIM组和酒精+DIM组,观察肝脏的病理改变和巨噬细胞相关炎症因子的表达;分离腹腔巨噬细胞,按正常对照组、酒精组(100 mmol/L)、DIM(10μmol/L)组和DIM(10μmol/L)+酒精(100 mmol/L)组处理后,观察原代巨噬细胞炎症因子的表达,Western blot检测NLRP3通路蛋白的表达。结果 病理结果显示,酒精组肝脏脂肪变性和炎症因子表达上升,DIM能够改善肝脏损伤和炎症细胞浸润。DIM明显降低了DIM+酒精组细胞因子TGF-β、TNF-α、IL-1a和IL-1b的水平。体外实验发现,DIM明显降低了酒精诱导巨噬细胞表达TGF-β、TNF-α、IL-1a和IL-1b的mRNA水平。蛋白检测的结果发现DIM明显降低了酒精诱导的NLRP3、Cleaved Caspase-1和Cleaved IL-1的蛋白水平。结论 DIM改善了小鼠酒精性肝病,抑制了巨噬细胞炎症因子的表达,NLRP3通路的下调可能是DIM抑制炎症因子表达的机制之一。