创伤修复剂——纯化的人血浆纤维连结蛋白活性的研究

目的建立测定人血浆纤维连结蛋白(FN)活性测定方法,研究在4℃保存的FN,贮存时间与浓度的关系。方法利用FN对明胶亲和特性,用明胶包被聚苯乙烯反应板,1%牛血清白蛋白封闭,随后加保存3、5、7个月,各浓度纯化的FN,25μg/m l抗人FN抗血清,HRP-金黄色葡萄球菌A蛋白。结果此法可测定FN活性,具有高度可重复性。FN浓度越高活性保存越好,浓度为30ng/m l以上纯化的FN4℃冷藏保存7个月仍具有一定活性。结论此法敏感度高、特异性强、重复性好,为FN活性保存条件提供可靠的检测数据。

聚乙烯醇-胶原创伤敷料的研制

研制一种新型的聚乙烯醇-胶原复合材料,探讨其作为创伤敷料的可行性。聚乙烯醇(PVA)与I型胶原以3∶1比例混合,以聚乙二醇为制孔剂,风干成为膜状,并对其进行抗张强度、孔径与孔隙率、吸水率检测及细胞生物相容性评价试验。结果显示:PVA-胶原膜的抗张强度为8·10±0·28MPa;平均孔径为100~150μm,孔隙率90%左右;吸水率为185·42%±6·93%;3T3细胞在PVA-胶原膜上生长形态正常,增殖迅速。因此,PVA-胶原膜具有较理想的力学强度、孔径与孔隙率以及良好的细胞相容性,可进一步探讨其作为创伤敷料的体内应用。

bFGF对体外关节软骨细胞创伤愈合与增殖的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ，ｂＦＧＦ） 对关节软骨细胞创伤愈合与增殖行为的影响。方法：采用体外创伤愈合模型及ＭＴＴ 比色方法，对软骨细胞创伤愈合与增殖行为进行分析。结果：ｂＦＧＦ浓度为５ｎｇ／ ｍｌ 时，即可显著促进软骨细胞创伤愈合，浓度为５０ｎｇ／ ｍｌ 时，其促进作用达到最大值。ｂＦＧＦ 也可促进软骨细胞增殖，１ｎｇ／ ｍｌ ｂＦＧＦ 即可促进第２ 代软骨细胞增殖，但不影响第５ 代细胞的增殖行为，当ｂＦＧＦ 达到１０ｎｇ／ ｍｌ 时，才显著地促进第５ 代细胞增殖。ｂＦＧＦ 浓度高至１００ｎｇ／ ｍｌ，其对两代细胞的促进作用不再提高。结论：ｂＦＧＦ 能够促进体外软骨细胞的创伤愈合和增殖，但对不同代数细胞的增殖作用有所不同，ｂＦＧＦ 促进细胞创伤愈合可能与其促进增殖有关。

胶原凝胶复合物治疗褥疮的临床研究

目的 探讨胶原凝胶复合物对各种类型褥疮的治疗效果。方法 采用Ⅰ型胶原为主要原料，研制出Ⅰ型胶原凝胶复合物（胶原凝胶），治疗Ⅱ°、Ⅲ°褥疮共３５例。结果 与对照组比较，胶原凝胶对创伤组修复的效果良好，Ⅱ°褥疮均２～３周内愈合，Ⅲ°褥疮４周内明显好转（占６０％）。结论 Ⅰ型胶原可促进肉芽生长及上皮再生，以Ⅰ型胶原为主要原料的胶原能明显缩短褥疮的治疗周期，是促进伤口愈合的良好生长材料，其成份、药效。

脱钙异体骨关节移植的初步实验研究

目的 探索利用脱钙异体骨关节移植修复节段性骨关节缺损。方法 在 2 4只新西兰兔的双侧桡骨近段造成 2 0mm长的骨关节缺损 ,分别移植脱钙异体骨关节和不移植骨关节 ,对照观察骨关节缺损的修复情况。术后 2～ 2 4周作X线照片、组织学检查和生物力学试验。结果 脱钙异体骨关节移植后 ,诱导生成新的骨关节 ,其形态和力学特征近似正常骨关节 ,没有出现关节退变、粘连或僵硬 ,关节功能基本正常。结论 脱钙异体骨关节具有低抗原性和高骨诱导能力的特点 ,可作为临床上重建节段性骨关节缺损的理想移植材料。

Ⅱ型胶原海绵修复关节软骨缺损的动物实验

目的探讨Ⅱ型胶原海绵修复关节软骨缺损的效果。方法采用成年纯种新西兰兔24只,48侧膝关节,在股骨滑车面钻孔为直径5mm、深3mm的全层关节软骨缺损,左侧为A组,在缺损区内完全填充Ⅱ型胶原海绵,右侧为B组,缺损区空白对照。术后12周内,每双数周对缺损修复情况行大体形态和组织学观察。结果Ⅱ型胶原对关节软骨缺损的修复有明显的促进作用,修复结果接近正常软骨。结论自行研制的高纯度Ⅱ型胶原海绵组织相容性好,无明显毒副作用,对关节软骨缺损具有良好的修复作用。

Ⅱ型胶原海绵的材料特性及对软骨缺损的影响

[目的]研究Ⅱ型胶原海绵的材料特性与其在修复软骨缺损中的作用。[方法]对比Ⅱ型胶原海绵与Ⅱ型胶原膜的力学、孔径方面等材料特性的差异,并建立兔膝关节软骨缺损模型,A组接受Ⅱ型胶原海绵移植,B组接受Ⅱ型胶原膜移植,而C组为空白对照组,术后不予治疗,分别于2、6和12周取材,通过组织学染色观察软骨缺损处修复的效果。[结果]Ⅱ型胶原海绵与Ⅱ型胶原膜在材料特性上有显著差异,胶原自发荧光分层扫描通过图像分析得出A组平均孔径为(93.26±38.41)μm,弹性模量(0.098±0.0017)MP/m2,均较B组更为理想。组织学显示A组6周时生成大量新生软骨,12周时新生软骨形态与成熟度已经接近正常,较B、C两组更为优越。[结论]Ⅱ型胶原海绵有理想的孔径和合理的生物力学结构性质,有利于软骨缺损的修复,是一种具有良好材料特性的组织工程基质。

正常与退变椎间盘纤维环细胞相关基因的差异表达

目的:研究人正常和退变椎间盘纤维环细胞椎间盘退变相关基因表达量的差异,探讨这些相关基因与椎间盘退变的关系,筛选明显差异基因作为退变纤维环细胞体外刺激因子,逆转椎间盘退变。方法:实时荧光定量PCR(real-time qRT-PCR,SYBR Green)技术检测人正常和退变纤维环细胞TGF-β、IGF-1、bFGF、IL-1、TIMP-1、COL1A1、BMP-14、PDGF、aggrecan、COL2A1、SOX 9、BMP-2、iNOS、EGF、MMP3、BMP-4和BMP-7mRNA表达水平。结果:与正常纤维环细胞相比,退变纤维环细胞TGF-β、IL-1、PDGF和IGF-1 mRNA表达量降低(P<0.01,P<0.05);bFGF、TIMP-1、BMP-14和COL1A1 mRNA表达升量高(P<0.01);正常纤维环细胞aggrecan和BMP-2 mRNA高表达,退变纤维环细胞两者表达阴性;COL2A1、iNOS和MMP3在正常纤维环细胞mR-NA有表达,在退变纤维环细胞表达阴性;EGF在正常纤维环细胞mRNA表达阴性,而在退变纤维环细胞有表达。Sox-9、BMP-4和BMP-7在正常和退变纤维环细胞mRNA表达均为阴性。结论:椎间盘纤维环退变与TGF-β、IL-1、PDGF、IGF-1、aggrecan和BMP-2 mRNA低表达,bFGF、TIMP-1、BMP-14和COL1A1 mRNA高表达相关;BMP-2、TGF-β、PDGF和IGF-1可作为退变纤维环细胞体外刺激因子,用于逆转椎间盘退变的研究;bFGF、TIMP-1和BMP-14可能是椎间盘纤维环细胞退变的标志物。

伤科接骨片对兔下颌骨缺损修复中骨保护素及配体基因表达的影响

目的探讨伤科接骨片在下颌骨缺损修复中的作用机制。方法健康雄性新西兰兔72只,随机分为正常对照组(24只)、模型组(24只)和伤科接骨片组(24只),建立下颌骨缺损模型。正常对照组、模型组动物给予正常饲料,伤科接骨片组动物给予伤科接骨片饲料。分别于建模后第7、14、28、56天处死相同例数动物(n=6),收集下颌骨缺损处骨组织块。采用RT-PCR技术检测骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)基因表达,免疫组化检测骨组织染色强度和面积。结果与正常对照组比较,模型组兔下颌骨组织OPGmRNA表达在建模后第7天显著上调(P<0.05),OPGL mRNA表达在建模后第14天显著上调(P<0.05);与模型组比较,伤科接骨片组建模后第14、28、56天OPGmRNA表达均上调明显(P<0.05),骨组织阳性染色更强,面积更广,建模后第14天OPGL mRNA表达下调明显(P<0.05),骨组织阳性染色更弱,面积更小,OPG mRNA/OPGL mRNA比值在建模后第14、28、56天明显上调(P<0.05)。结论伤科接骨片促进下颌骨缺损修复的作用可能与其调节OPGmRNA、OPGL mRNA表达水平有关。

氢化可的松和胰岛素对兔软骨细胞生长的影响

目的 :观察胰岛素和氢化可的松对软骨细胞生长的影响。方法 :取新西兰兔膝关节软骨细胞 ,分别加入胰岛素、氢化可的松或二者的复合物的培养液中培养 ,用MTT法测定其对软骨细胞增殖的影响。结果 :单独使用胰岛素0 .0 35 μg/ml即可显著促进软骨细胞增殖 (P <0 .0 1) ,当浓度增至 0 .35 μg/ml时 ,其促进作用达到最大值 (P <0 .0 1)。氢化可的松 10 μg/ml时对软骨增殖的抑制作用明显 (P <0 .0 5 )。随着氢化可的松浓度的增大 ,抑制作用更显著 ,当浓度增至 10 0 μg/ml时 ,软骨细胞几乎全部死亡 (P <0 .0 1)。当胰岛素 0 .35 μg/ml与氢化可的松 5 0 μg/ml联合使用时 ,氢化可的松可以拮抗胰岛素的作用。结论 :低浓度胰岛素对软骨细胞的生长有促进作用。氢化可的松对软骨细胞的生长有抑制作用。二者联合使用时 ,氢化可的松可以拮抗胰岛素的作用。

检测人成纤维细胞增殖的XTT比色法

利用 3种不同来源的成纤维细胞 (大鼠肾上皮细胞 ,人胎肺成纤维细胞 ,人成纤维细胞 )的活细胞线粒体脱氢酶在电子偶联剂硫酸酚嗪甲酯 (phenazinemethosulfate,PMS)的协同作用下 ,还原四氮唑复合物 (XTT)形成可溶性的棕黄色甲簪 (formazan)产物 ,测定细胞甲簪的生成量来反映细胞的生长与活性状态 ,并与传统的四甲基偶氮唑盐 (MTT)方法作比较 .结果表明 ,XTT方法直接测定水溶性的甲簪产物 ,敏感度高于MTT法 ,具有操作简单、快速、灵敏度高、结果准确的优点 ,为成纤维细胞的研究建立了新的检测方法 .

Caspase 3 siRNA抑制关节软骨细胞的凋亡

背景:到目前为止,国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上,而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因,在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道。目的:利用慢病毒载体,把Caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使其caspase 3基因沉默,相对阻断凋亡效应的联级反应,期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成。材料:软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取,caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建。方法:构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-Caspase 3 siRNA表达质粒,使用慢病毒包装系统,在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞。主要观察指标:实时荧光定量-聚合酶链反应和Westernblot检测转导后软骨细胞caspase 3基因沉默情况,再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡,流式细胞技术AnnexinV/PI检测软骨细胞凋亡情况。结果:Caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞,转导率达90%;实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中Caspase 3mRNA的表达量,实验组低于与对照组差异有显著性(P<0.01);Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量,实验组低于与对照组差异有显著性意义(P<0.01);在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时,caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍。结论:利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使软骨细胞的caspase 3基因沉默,可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的。

丹酚酸B促进人软骨细胞生长并上调β-连环蛋白和类细胞介素-1的表达

为探讨中药丹参的主要活性成份丹酚酸B对人软骨细胞系C28112细胞的增殖作用及其调节作用机制中相关因子的初步辨识采用MTS法检测丹酚酸B的对软骨细胞作用的有效浓度;吖碇橙荧光标记软骨细胞的DNA及RNA,观察细胞分裂及形态学改变;Western Blotting(WB)检测β-Catenin及新型软骨生长因子类细胞介素1的蛋白质表达。结果显示MTS法检测加入丹酚酸B后的所有剂量实验组与对照组比较吸光度值均有不同程度的增高,差异均有统计学意义(P<0.01);丹酚酸B实验组可见明显核分裂及较多的双核现象,细胞增生较活跃;半定量WB分析结果显示丹酚酸B实验组比对照组的类细胞介素1蛋白表达量显著升高,β-Catenin蛋白质表达量亦显上调趋势。表明丹酚酸B能促进人软骨细胞的增殖并上调了相关因子的表达。其作用机制可能与丹酚酸B作用于软骨细胞中Wnt信号调节通路,上调信号调节因子β-Catenin表达量,激活靶基因类细胞介素1的转录并促进其表达释放有关。

酸性成纤维细胞生长因子复合胶原海绵的制备及其疗效观察

以Ⅰ型胶原蛋白、酸性成纤维细胞生长因子(acidFibroblastGrowthFactor,aFGF)为主要原料,研制一种新型的创伤敷料,并对其进行了临床试验。制备高纯度的Ⅰ型胶原蛋白溶液,透析至中性,加入aFGF溶液冷冻干燥成为海绵体。再进行生物安全性评价试验,包括急性毒性试验、刺激性试验、致敏试验、溶血性试验、细胞毒性试验以及动物体内埋植试验;在临床上选取开放性创面进行贴敷,评价其治疗效果。结果:aFGF胶原海绵的毒理学试验结果均呈阴性,在兔肝埋植试验中未见异常反应,8周内降解;临床上应用具有促进创面愈合,阻止渗液溢出的效果。所研制的aFGF胶原海绵无毒副作用,具有良好的临床疗效,具备推广应用的前景。

XTT-PMS法检测肝癌细胞的药敏性

目的 :建立检测肝癌细胞生长与药敏性的新方法。方法 :用XTT -PMS法检测肝癌细胞生长与药敏性。结果 :XTT -PMS法检测的适宜条件为XTT 0 2mg/mL ,PMS 5～ 5 0 μmol/L ,作用时间 2～ 6h。采用该法测定肝癌细胞药敏性的结果与MTT法相似。结论 :XTT -PMS法操作简单快速 ,测定结果准确可靠 。

聚乙烯醇纺丝纤维编织在组织工程前交叉韧带支架材料中的应用

探讨聚乙烯醇(PVA)纺丝纤维编织用I型胶原胶(COL-I)表面修饰后,构建组织工程前交叉韧带(ACL)支架材料的可行性。用PVA纺丝编织成条束状支架材料,用NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带(HACL)细胞分别种植到PVA和经COL-I修饰过的PVA纺丝纤维编织(PVA/COL)支架材料上,立体培养。通过扫描电子显微镜对比评价材料经I型胶原胶表面修饰前后NIH-3T3细胞株和HACL细胞在纺丝编织材料上细胞附增殖情况;在电子拉力机上测试PVA纺丝纤维编织支架材料的力学性能。结果表明:NIH-3T3细胞株和HACL细胞在PVA和PVA/COL支架材料表面和孔隙内黏附增殖并分泌细胞外基质,在PVA/COL支架材料上细胞黏附数量明显增多;COL-I可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质,但对HACL细胞作用不明显。拉力测试该编织材料柔韧性强,最大负荷、极限应力和弹性模量分别为52.61 N、14.96 Mpa和202.08 Mpa。说明I型胶原可促进NIH-3T3细胞株和HACL细胞在聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附、增殖,可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质。聚乙烯醇纺丝纤维编织材料具有一定的力学性能和细胞相容性,有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料。

一氧化氮在骨关节炎治疗过程中的动态变化及意义

通过-动态监测关节-炎腔-内注射药物后,血液中一氧化氮(Nitricoxide,NO)水平的变化,探讨药物对骨关节炎的治疗机理及NO的变化与骨关节炎的关系。方法:采用Hulth动物模型,在手术后当时及术后每二周,实验组在关节腔内分别注射治疗药物1%透明质酸钠及Ⅱ型胶原;对照组注射生理盐水。在术后当时及每二周,作骨关节的常规病理检查测及兔血NO含量测定。结果:在术后3个月的观察期内,1%透明质酸钠及Ⅱ型胶原引起关节软骨及滑膜的明显或显著增生,而NO水平在术前术后无显著变化,P>005,对照组中,术后4周、6周,NO水平明显升高,术后8周趋于正常,此时出现滑膜增生反应。结论:两种治疗药物的治疗作用与抑制NO的生成有一定相关性,骨关节炎兔血NO水平升高;在关节软骨及滑膜明显增生时,NO水平趋于正常。因此监测NO水平的变化,可在一定程度上监测治疗药物的作用及关节炎的病情变化。

胶原在软骨组织工程中的应用

软骨组织工程的出现,为解决软骨修复这个临床难题提供了新的方法。然而寻找一种合适的生物载体材料是目前软骨组织工程的热点。胶原是一种天然支架材料,具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性,可作为细胞三维生长支架,并且有维持种子细胞增殖、黏附和分化的能力。本文就胶原及其复合材料在软骨组织工程方面的应用状况与前景作一综述。

聚乙烯醇-胶原凝胶研制及作为组织替代材料的生物相容性[英文]

背景：聚乙烯醇对细胞黏附能力有限,在聚乙烯醇中加入胶原蛋白能否改善其细胞的黏附性？目的：研制一种新型的聚乙烯醇-胶原复合材料,并探讨其作为软组织替代材料的可行性。设计：单一样本观察。单位：暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所。材料：选用15只新西兰大白兔,体质量2.0~3.0kg,雌雄不拘,由广东省医学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。广州市创伤外科研究所市级实验室完成。牛I型胶原购自广州创尔生物技术有限公司,聚乙烯醇-124购自广州南方化玻仪器公司。方法：实验于2003-07/2006-12在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院完成。①聚乙烯醇-胶原材料制备：配制5g/L的牛Ⅰ型胶原与5%的聚乙烯醇-124以1∶1混合,真空冷冻干燥成为凝胶状,扫描电镜观察其内部结构。②细胞毒性试验：聚乙烯醇-胶原材料剪成10mm×5mm×1mm小片,γ射线消毒后,分别放入48孔平板中,每孔加入1×104个3T3细胞培养,扫描电镜观察细胞的生长状况。③体内埋植试验：将实验兔背部脊柱两侧各作2个纵切口,形成皮下腔隙。分别于手术形成的皮下腔隙植入4块聚乙烯醇-胶原材料,分别于术后1,4,8周各取3只实验共9块标本及其周围组织作病理观察。主要观察指标：扫描电镜观察凝胶膜内部结构、细胞毒性试验及体内埋植试验结果。结果：①聚乙烯醇-胶原材料内部结构：真空冷冻干燥的聚乙烯醇-胶原为白色的凝胶,扫描电镜见其表面和切面内部有贯通的三维孔隙。②细胞毒性试验结果：3T3细胞在PVA-胶原材料上能三维生长、形态正常。③体内埋植试验结果：聚乙烯醇-胶原植入1周后,产生了正常的异物反应,材料与组织界限分明。4周后,只见极少量淋巴细胞浸润,大量的纤维母细胞增生形成胶原纤维和假单层立方上皮细胞包裹材料。8周未见淋巴细胞浸润、中性粒细胞和异物巨细胞,囊壁致密,大量的纤维母细胞增生形成包膜包裹材料。16周可见囊壁致密,胶原纤维变长,排列规则,核变小,呈长卵圆形或长梭形,无新生小血管,无淋巴细胞、中性粒细胞和异物巨细胞浸润,囊壁稳定、变薄。结论：聚乙烯醇-胶原材料无毒副作用,具有良好的细胞相容性与组织相容性,可安全地应用于体内移植。

以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法

目的 :介绍以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法的优点。方法 :从鼠尾中提取Ⅰ型胶原蛋白 ,制备胶原膜作培养皿基底 ,进行表皮细胞培养 ,并比较 4种不同基底的培养方法。结果 :以胶原膜作基底培养的表皮细胞无论是单细胞或组织块都生长最好 ,在第 14天均能开始汇合成片 ,且无毒副作用。结论 :该培养法改进了过去培养表皮细胞膜片过薄、韧性欠佳、刮取皮片时造成皮片回缩等缺点 ,方便了创面移植 ,且胶原膜本身也能促进创面愈合 。