液相芯片技术定量检测人血清CEA、AFP和NSE

目的建立利用液相芯片技术定量检测人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和神经原特异性烯醇化酶(NSE)的反应模式,并对该方法各项指标进行评价。方法制备抗体交联微球及生物素标记抗体,用双抗夹心法检测临床血清标本。结果同时检测CEA、AFP和NSE时的线性范围分别为0.078～200ng/ml、0.025～25U/ml、0.146～75ng/ml,最低检测限分别为39.1pg/ml、0.016U/ml、0.073ng/ml,分析内精密度<10%,分析间精密度<15%。检测CEA、AFP、NSE的灵敏度分别为97.2%、100%、93.5%,特异度分别为96.4%、97.7%、97.0%,准确度分别为96.9%、98.4%、95.3%。检测结果与化学发光免疫分析法(CLIA)呈显著的等级相关关系,而且仅需1!l标本,3h就可以完成检测。结论液相芯片技术具有可联合检测多项指标、高通量、线性范围宽、灵敏度高、重复性好和节省样品和时间等优点,具有极大的临床应用潜力。

乙型肝炎病毒核心抗体IgM时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制

目的利用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立乙型肝炎病毒抗HBc-IgM的检测试剂盒。方法采用捕获法建立抗HBcIgM TRFIA检测试剂盒,对自制试剂盒的各项性能指标进行评估。结果用自制质控品检测分析内和分析间的精密度分别为4.8～7.2%,7.5～8.6%;与抗-HBs,抗-HBcIgG和抗-HBe无交叉反应;对584份血清样本进行检测并与国产酶联免疫法试剂盒对比,结果显示自制试剂盒的灵敏度更高;300份健康者血清样本检测结果表明,该试剂盒的cutoff值=阴性对照荧光值×3.5。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代酶免法试剂盒。

Aeropyrum pernix K_1磷脂酶A_2的克隆、表达及其性质

从超嗜热需氧古细菌Aeropyrum pernix K1中抽提出染色体基因组，经PCR扩增得到磷脂酶A2基因，用带有His—tag标记的pET15b作为表达载体，在大肠杆菌BLP中成功地诱导表达。表达产物经过Ni-螯合柱一步得到纯化。SDS—PAGE检测只有一条带，其准确分子量为17，871kD。对纯化后的磷脂酶A2测定其酶活性和生物活性，得出其最适反应温度为90％，最适pH范围为7．8-8．2。至此首次成功地在大肠杆菌中表达了古细菌嗜热磷脂酶A2，这将为以后对该酶的结构和功能以及耐热机制研究打下很好的基础，同时有利于古细菌研究领域的扩展。

SARS-CoV GDH株N蛋白全长基因克隆及其可溶性表达

目的构建SARS冠状病毒N蛋白的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达并纯化,鉴定其抗原性。方法以我国SARS冠状病毒GDH株总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增N蛋白的全长基因,TA克隆后测序。构建pET-23d的N基因表达载体,用IPTG诱导目的蛋白表达,利用硫酸铵沉淀、分子筛层析及离子交换层析纯化重组蛋白,免疫印迹鉴定重组蛋白。结果RT-PCR扩增出1269bpSARS冠状病毒N蛋白的基因片段,其序列分析结果与SARS-CoVGD01、BJ01株的同源性为99.92%;该基因在大肠杆菌表达系统中高效表达,占可溶性蛋白的33.57%,表达产物为非融合的可溶性蛋白,Westernblot结果显示重组N蛋白具有良好的抗原性;纯化后重组N蛋白纯度为92.9%。结论成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒,并在大肠杆菌中以非融合蛋白的形式得到高效的可溶性表达,为SRAS的诊断和疫苗的研制奠定了基础。

癌胚抗原的时间分辨免疫荧光分析及其诊断试剂的研制

目的：利用时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）技术，建立一种人血清癌胚抗原（CEA）的快速全自动检测方法并研制其诊断试剂。方法：采用双抗体夹心法（用1株抗CEA的mAbM86160M用于包被微孔板，另1株抗CEA的mAb M86110M用于标记铕）建立CEA—TRFIA，增强液采用B-二酮体为主的发光增强系统。结果：CEA-TRFIA的线性测量范围为（1～560）μg／L，分析的灵敏度为0．28μg／L，批内和批间的变异系数（CV）分别为7．2％～8．6％和8．9％～13．2％。与AFP，CA12—5、CA19—9和白蛋白均无交叉反应，与CA15—3的交义反应值为1．62μg／L。将1000份血清标本用本法与国外罗氏化学发光试剂盒同时检测，其相关系数（r）为0．946。结论：CEA—TRFIA的各项指标均达到临床检测的要求，可替代国外同类检测试剂盒，用于临床血清CEA水平的测定。

C肽与胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析法的建立及初步临床应用

建立钐(Sm3+)标记检测C肽(C-peptide)及铕(Eu3+)标记检测胰岛素(insulin)的双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),并初步尝试检测人血C肽以及胰岛素含量.将抗C肽单克隆抗体(Biodesign No.E54094M)与抗insulin单克隆抗体(BiodesignNo.E86306M)混合包被96孔板,然后用Sm3+标记抗C肽单克隆抗体(Medix No.9103),Eu3+标记抗insulin单克隆抗体(Biodesign No.E86802M),运用双抗体夹心一步法建立C肽/胰岛素双标记时间分辨免疫荧光分析法.结果显示:C肽分析灵敏度为0.2μg/L,线性范围为0.5～22μg/L,平均回收率达到99.6%,分析内和分析间变异系数分别为4.6%～6.0%和5.1%～7.6%.胰岛素分析灵敏度为0.8 mU/L,线性范围为3.6～180 mU/L,平均回收率为99.4%,分析内和分析间变异系数分别为3.7%～6.0%和5.1%～8.0%.C肽/胰岛素双标记检测试剂与PerkinElmer公司对应的单标记进口试剂盒分别同时测定血清样本200份,检测结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.98与0.99.总之,自建C肽/胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析方法的性能均可以达到临床检测要求,有望替代现有国内外较为昂贵的单标记试剂,可用于胰岛素分泌不足导致的糖尿病诊断及糖尿病的大规模普查筛选.

HBeAb光激化学发光免疫分析试剂盒的研制

目的研制光激化学发光免疫分析技术(AlphaLISA)建立人血清乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的快速检测试剂盒。方法采用中和抑制法建立HBeAb AlphaLISA试剂盒。结果自制HBeAb试剂盒灵敏度为0.003NCU/ml,可测范围为0.003-16NCU/ml。批内与批间的精密度分别为5.3%和6.8%,与HBcAb无交叉反应。使用自制试剂与罗氏化学发光试剂盒同时检测136份临床血清样本,结果具有相关性(r=0.961)。结论自制HBeAb AlphaLISA试剂盒的各项性能指标能够达到临床检测要求,可用于临床血清样本HBeAb浓度的测定。

CA125时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制

目的研制CA125时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)试剂盒。方法采用双抗体夹心法建立CA125TRFIA试剂盒,对试剂盒各项指标进行评价。结果该试剂盒的工作范围为10～600U/m l,分析灵敏度为1.07U/m l,批内、批间的精密度分别为4.5%～8.1%,6.9%～11.5%。与CEA、AFP、CA50、CA15-3、CA19-9无交叉反应。稳定性试验表明试剂可以在4℃稳定1年,37℃稳定7d。425份正常血清标本测试该试剂盒的正常参考值范围是0～37U/m l。123份血清标本用本试剂盒与国外其他方法的同类试剂盒同时检测,其相关系数为0.939。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代国外同类产品试剂盒。

人甲胎蛋白时间分辨免疫荧光分析试剂盒的研制

目的研制人甲胎蛋白(hAFP)时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)试剂盒.方法采用双抗体夹心法建立AFP TRFIA 试剂盒,对试剂盒的各项指标进行评价.结果试剂盒的可测范围为l～1 000 U/ml,灵敏度为0.17 U/ml,精密度良好,批内和批间的精密度分别为3.3%～5.9%,3.7%～6.5%.与CEA、CA12-5、CA19-9、CA15-3、白蛋白无交叉反应.稳定性试验表明试剂可以在4℃稳定1年,37℃稳定7 d.426份正常血清标本测试该试剂盒的正常参考值范围是0～12 U/ml.用本试剂盒与国外同类试剂盒同时检测60份血清标本,其相关系数为0.995.结论试剂盒各项指标(灵敏度、精密度、特异性、稳定性、准确度)均达到临床检测要求,可替代国外同类产品试剂盒.

时间分辨荧光免疫法定量检测AFP试剂盒临床应用研究

对自制AFP时间分辨荧光免疫法(TRFIA)试剂盒进行研究,为临床应用评价提供科学依据。收集血清标本450份,分别以化学发光免疫分析(CLIA)和RIA为对照,用AutoDELFIATMhAFP试剂盒为复核试验,测定血样,获取实验数据并计算“真实性”和“可靠性”。结果表明,CLIA及RIA为对照试验,其阳性符合率分别为99.0%和97.4%,阴性符合率分别为97.2%和94.1%,检验均无显著性差异(P>0.05)。本试剂盒的定量测定值与CLIA比较接近,相关系数为0.994,与RIA为0.917,两者相关性好(P<0.01)。本试剂盒检测性能能满足临床应用的需要。

人促卵泡激素时间分辨荧光免疫分析检测试剂的研制

目的利用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术建立人血清促卵泡激素（hFSH）的检测试剂。方法采用双抗体夹心法建立hFSH—TRFIA检测试剂，对试剂的各项指标进行评价。结果hFSH—TRFIA检测试剂的测量范围为1～256U／L，灵敏度为0．08U／L，分析内和分析间的精密度分别为2．6％～4．2％，6．1％～8．6％，与人黄体生成素（hLH）、人促甲状腺素（hTsH）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）的交叉率分别为0．14%，0．08％和0．01％。30份异常血样用该试剂与进口的同类试剂同时检测，其相关系数为0．993。结论试剂各项指标均达到临床检测要求，可替代国外同类产品。

伏马毒素B1时间分辨免疫荧光检测试剂盒的研制

目的:为快速检测食品中的伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1),制备抗FB1的单克隆抗体并利用该抗体研制基于时间分辨免疫荧光分析方法的检测试剂盒。方法:在建立抗伏马毒素B1单克隆杂交瘤细胞株的基础上,采用小鼠腹腔注射法生产大量腹水,经Protein A亲和层析柱分离纯化、透析后得到单克隆抗体,利用所得抗体建立间接竞争性时间分辨免疫荧光分析试剂盒并优化各参数:线性范围、检出限及与黄曲霉毒素(aflatoxins,AFB1)、呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)和载体蛋白BSA等的交叉反应性;对试剂盒稳定性采用37℃破坏实验;采用3个浓度的加标回收试验确定回收率;对19份样品及FB1玉米盲样进行检测,并同时用市售ELISA试剂盒进行验证。结果:所研制试剂盒的最低检出浓度为2ng/mL,检测线性范围为2～512ng/mL,线性方程2为Y=-0.644X+12.872(R=0.998),50%抑制浓度为10.07ng/mL,加标提取后,玉米样品3个加标水平的回收率在78.32%～116.76%之间,与AFB1、DON和BSA均无交叉反应性,试剂盒常温下可保存315d以上。结论:本研究建立了快速、敏感检测FB1的时间分辨免疫荧光检测试剂盒。

C肽光激化学发光免疫分析试剂盒的研制

目的：研制光激化学发光免疫分析技术（AlphaLISA）建立人血清C肽（C peptide）的快速检测试剂盒。方法：采用夹心法建立C peptide AlphaLISA试剂盒。结果：自制C肽试剂盒灵敏度为0.06ng/ml.,可测范围为（0.06~22）ng/ml。批内与批间的精密度分别为4.0%~4.8%,5.6%~6.8%,与胰岛素以及胰岛素原无交叉反应,使用本试剂盒与CMIA-ARCHITECT试剂盒同时检测98份临床血清样本,结果具有相关性,其相关系数为0.973。结论：自制C肽AlphaLISA试剂盒的各项性能指标能够达到临床检测要求,可用于临床血清样本C肽浓度的测定。

时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA)试剂临床应用研究

目的对自制时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA)试剂盒进行临床应用研究,为该试剂盒临床应用及临床疗效评价提供科学依据。方法收集血清标本326份,用自制试剂盒按试剂盒操作说明书对血样进行测定,并以化学发光法(R oche)为对照方法,W ALLAC公司的CEA时间分辨免疫测定药盒(A u toDELF IATMhCEA)作为复核试验,获取相关目标实验数据,并计算得“真实性”和“可靠性”等统计学数据。结果以化学发光法为对照试验,其阳性符合率为95.83%,阴性符合率为98.73%,检验无显著性差异;自制试剂盒的定量测定值与化学发光法的测定值较为一致,相关系数达0.93,相关性好。结论试剂盒检测性能与现在临床广泛应用的方法相仿,能满足临床应用的需要。

人催乳素时间分辨荧光免疫分析检测试剂的研制

目的建立人血清催乳素的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法。方法采用双抗体夹心法建立人血清催乳素TRFIA检测试剂盒,对试剂盒的各项指标进行评价。结果试剂盒的定量范围为16～11000mU/L,灵敏度为1.36mU/L,批内批间的精密度分别为2.6%～7.6%,5.7%～9.0%;与人胎盘泌乳素(hPL)、人生长激素(hGH)、人黄体生成素(hLH)和人促卵泡激素(hFSH)无交叉反应。30份异常血样用本试剂盒与进口的同类试剂盒同时检测,其相关系数为0.997。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代国外同类产品试剂盒。

游离雌三醇时间分辨免疫荧光分析法的建立

目的建立游离雌三醇(uE_3)时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)方法。方法采用竞争抑制一步法建立检测uE_3的TRFIA分析方法,并对该试剂的各项性能指标进行评价。结果该方法的灵敏度为0.14nmol/L,线性范围为0.14～120nmol/L,回收率为97.7%。分析内和分析间变异系数分别为1.6%～4.1%和4.4%～8.8%。与E_2、孕酮和睾酮的交叉反应率分别为0.24%、0.36%和0.40%。149份血样用本试剂与进口的同类试剂同时检测,其相关系数为0.925。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代国外同类产品试剂盒。

时间分辨免疫荧光法定量检测甲胎蛋白(AFP)试剂的性能研究

目的在成功建立时间分辨免疫荧光法定量检测甲胎蛋白(AFP)反应模式并确定该检测试剂盒的生产工艺后,对该试剂盒的产品性能进行测定和评估。方法按试剂盒操作说明书对试剂盒的准确度、精密度、剂量-反应曲线、最低检测量、稳定性、特异性等指标进行测定。结果试剂盒准确度好,其线性检测范围为1～1000IU/ml,最低检测量为0.11IU/ml,分析内精密度<5%,分析间精密度<10%。CEA(1000ng/ml)、CA125(600IU/ml)、CA15-3(500IU/ml)、CA19-9(500IU/ml)及白蛋白(1000ng/ml)与本试剂盒AFP的交叉反应值分别为0.35、0.28、0.25、0.31、0.42IU/ml。结论试剂盒各项性能指标均达到相关检定要求,满足临床检测的需要。

超敏C-反应蛋白时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的：血清超敏C-反应蛋白（CRP）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）法的建立．方法：采用双抗体夹心法检测血清CRP水平（1株抗CRP的单抗用于包被微孔板，另1株抗CRp的单抗用于Eu^3＋标记）．结果：TRFIA的线性测量范围为1—1000mg／L，灵敏度为0．06mg／L，批内和批间精密度分别为4．0％～7．2％，6．7％-10，8％．与人IgG和白蛋白未见明显的交叉反应．109份血清标本用本方法与国外试剂盒同时检测，其相关系数为0．916．结论：CRP-TRFIA各项指标均达到临床检测要求，可替代国外产品试剂盒，用于临床血清CRP的测定．

CA15-3时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制

目的:利用时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)技术建立人血清糖类抗原CA15-3的检测试剂。方法:采用双抗体夹心法建立CA15-3-TrFIA检测试剂,对试剂的各项性能指标进行评价。结果:CA15-3-TrFIA检测试剂的测量范围为(2～300)U/L,灵敏度为2U/L,分析内和分析间的精密度分别为5.6%～6.1%,7.1%～8.4%;与CEA、CA125、CA19-9和CA50无交叉反应。402份正常女性血清标本测试结果表明,该试剂的正常参考值范围是(0～30)U/ml。30份临床血样用本试剂与进口的同类试剂同时检测,其相关系数为0.922。结论:试剂各项指标均达到临床检测要求,可替代国外同类产品。

人生长激素的时间分辨荧光免疫分析及其诊断试剂研制

【目的】利用时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术,建立人生长激素(human growth hormone,hGH)的快速检测方法并研制其诊断试剂。【方法】采用双抗体夹心法(一株抗GH的单抗用于包被微孔板,另一株抗GH的单抗用于Eu3+标记)建立hGH-TRFIA。【结果】hGH-TRFIA的线性测量范围为0.1×10-3～100×10-3U/L,灵敏度为0.036×10-3U/L,批内和批间的变异系数分别为5.3%～8.6%和7.6%～12.8%。与促甲状腺激素(TSH)、卵泡生成素(FSH)、人胎盘催乳素(LH)和黄体生成素(HPL)均无交叉反应。将43份血清标本用本法与Wallac试剂盒同时检测相关系数(r)为0.957。【结论】hGH-TRFIA可作为一种具有灵敏度高、特异性强和测量范围宽的新方法,用于临床GH水平的测定。