利用NGS技术同时检测缺失和点突变型地中海贫血

目的建立一种跨越断裂点PCR(Gap-PCR)结合下一代测序技术的地中海贫血基因检测方法。方法对地中海贫血核酸国家参考品进行PCR扩增,PCR产物进行高通量测序。结果 32例国家参考品涉及的3种α突变型别,16种β突变型别,4种α缺失型别,2种β缺失型别全部检出,均与原型别一致。结论本研究通过建立基于Gap-PCR结合下一代测序技术检测地贫的方法进一步完善了遗传病基因诊断方法,对遗传病的携带人群筛查,优生优育咨询,防止出生缺陷等方面具有重要意义。

应用微阵列比较基因组杂交技术检测乳腺癌患者共有拷贝数变异的初步研究

目的探讨乳腺癌患者基因组中共有的拷贝数变异与乳腺癌发生发展的关系,为乳腺癌的预防、治疗和预后提供基本依据。方法使用微阵列比较基因组杂交技术检测样本基因组DNA的拷贝数变异。将得到的拷贝数变异在人类基因组变异数据库和孟德尔遗传数据库进行变异分析,寻找样本共有的拷贝数变异并分析其与乳腺癌的关系。结果发现1q21、8p11、8p12、8q11、14q32、14q32.33(其中包含2个片段),20q13和22q11共9个共有拷贝数变异,其中4个拷贝数变异通过人类基因组变异数据库证实为正常多态性拷贝数变异。有5个拷贝数变异在人类基因组变异数据库中不存在相似片段并且在孟德尔遗传数据库中有致病基因,包括4个扩增片段和1个缺失片段。结论1q21.1q42.2、8q21.12q23.3和20q13.2q13.31 3个片段的扩增及8p12p11.23的缺失与乳腺癌的发生和发展有一定联系,但8q11.22q11.23的扩增与乳腺癌的发生、发展的相关性尚有待于进一步验证。

基于三引物荧光PCR-毛细管电泳法的FMR1基因突变检测技术建立及其在自闭症辅助诊断中的应用

目的对自闭症患者FMR1基因5′非编码区CGG重复序列及重复数进行检测,探索检测脆性X综合征的新方法。方法应用三引物荧光PCR-毛细管电泳法(Qseq100TM全自动核酸分析系统检测)对111例自闭症患者进行筛查,检测其FMR1基因5′非编码区CGG序列,计算CGG重复数,并与ABI 3500Dx基因分析仪毛细管电泳测序法进行结果比较验证。结果 111例临床检测为自闭症的样本中,有2例为FMR1前突变携带者,一例为中间型。与3500Dx毛细管电泳测序结果一致。结论三引物荧光PCR-毛细管电泳法能够用来检测FMR1基因5′非编码区CGG重复序列,在脆性X综合征发病机制及大规模携带者筛查方面都具有一定的应用价值。

基于高通量测序技术无创筛查双胎染色体非整倍体及胎儿游离DNA浓度分析

目的评估无创高通量测序方法筛查双胎染色体非整倍体的可行性,并对胎儿游离DNA浓度进行分析。方法收集双胎妊娠样本120例,包括自然双胎67例,辅助生殖技术植入的双胎47例,双胎消失综合征样本6例,并收集68例单胎样本作为对照,采用无创高通量测序方法进行检测。通过Z值进行阴性和阳性判断,根据Y染色体唯一比对条数进行胎儿游离DNA浓度计算,并对三体阳性样本进行核型分析。结果本次实验筛查出2例双胎染色体三体阳性样本,分别为正常/21三体和13三体/18三体,均与核型结果一致。自然双胎妊娠组胎儿游离DNA浓度明显高于辅助生殖技术植入双胎组、双胎消失综合征组和自然妊娠单胎组,P值均小于0.05。其他3组间胎儿游离DNA浓度无显著性差异。结论采用无创高通量测序方法进行双胎妊娠染色体非整倍体筛查也是可行的,同时结果分析应该考虑胎儿游离DNA浓度的影响。

应用下一代测序技术对α地中海贫血进行胚胎植入前遗传学检测

目的探讨下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术在α地中海贫血胚胎植入前遗传学检测中的应用。方法选取2对α地中海贫血--SEA缺失型携带者夫妇体外受精胚胎活检后的6个胚胎样本应用全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术、下一代测序技术进行胚胎植入前遗传学检测,同时采用跨越断裂点荧光PCR(gap-PCR)进行平行对照检测。结果 2个家系6个胚胎样本的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)结果分别为--SEA/αα母源携带、--SEA/--SEA、--SEA/αα母源携带、--SEA/--SEA、--SEA/αα母源携带和--SEA/--SEA;胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)结果分别为45,XX,-5、46,XX、46,XY、47,XY,+1、46,XX和46,XY,+1,-2;Family 1 gap-PCR检测结果为父母均为SEA杂合子;E1为正常、E2为SEA纯合子、E3为正常;Family 2检测结果分别为:父母均为SEA杂合子;E4为SEA纯合子、E5为正常、E6为SEA纯合子。结论结果显示利用NGS不仅可以检测出23对染色体的核型,同时解决了单细胞扩增等位基因脱扣(allele drop-out,ADO)造成的假阳性和假阴性的风险,更具有市场潜力及应用前景。

微阵列比较基因组杂交技术与二代基因测序检测拷贝数变异的对比

目的对比分析微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)和第二代基因测序技术(next generation sequencing,NGS)在基因组拷贝数变异(copy number variation,CNV)上的一致性,为临床检测CNV提供新的检测方法。方法提取15例流产组织临床样本的基因组DNA,然后分别使用aCGH和NGS 2种方法对上述DNA进行检测,分析对比每个样本的CNV的数目。结果 aCGH共检测到CNV数有109个,最小的片段有16 kb,最大的片段有34 Mb,其中小于200 kb的有20个,大于200 kb小于1 Mb的有34个,大于1 Mb小于5 Mb的有26个,大于5 Mb小于34 Mb的有29个。NGS共检出68个CNV,其中小于200 kb的有3个,检出率为15.0%;大于200 kb小于1 Mb的有22个,检出率为64.7%;大于1 Mb小于5 Mb的有20个,检出率为76.9%;大于5 Mb小于34 Mb的有29个,检出率为100.0%。结论对于目前的数据量来说,NGS在检测大于5 Mb的大片段CNV上检出率较高,与aCGH具有一定的一致性,可以应用于流产组织中CNV的检测。对于小片段的CNV的检测,需要增加相应的读取的数据量进行检测。

生物医药企业内部控制问题及应对措施

生物医药行业在我国拥有着极为蓬勃的生命力,具有广阔的发展前景。与此同时,行业内的竞争日趋激烈。在"互联网+"的时代,各行各业都面临着新的挑战与机遇,生物医药企业面临着国际医药巨头抢占市场与医疗深化改革的压力。为了加强企业自身的市场竞争力,生物医药企业需要积极地完善内部控制管理。本文从内部控制管理的角度出发,分析当前中小型生物医药企业在内部控制管理工作中存在的问题进行分析,并探讨相关解决措施,以供生物医药企业参考。

基于二代测序的染色体非整倍体无创产前筛查孕妇血浆中胎儿DNA比例的检测和计算方法

孕妇血浆中胎儿游离DNA的发现已对胎儿染色体非整倍体异常的无创产前检测产生了巨大的变革,母体血浆中的游离DNA越来越被认为是非侵入性检测胎儿发育异常的重要指标。二代测序技术的发展也使染色体非整倍体无创产前筛查(noninvasive prenatal test,NIPT)在临床实践中得到了迅速的开展和推广应用。在NIPT筛查中,血浆中胎儿游离DNA比例是整体检测性能的关键参数,在一定程度上确保对检测结果作出正确的临床解释。本综述中,我们对目前NIPT中胎儿游离DNA比例的检测方法和生物信息学算法进行介绍,并简单讨论各个方法的优缺点。

广东地区200例正常人耳聋基因突变数据库的建立

目的通过对200例广东地区正常人进行耳聋基因突变筛查,获得耳聋相关基因突变检测的数据库,初步筛出良性等位基因突变位点,以在对广东地区人群进行耳聋基因突变检测或筛查时,降低数据分析的时间和增加对结果的风险预测能力。方法提取在广东地区收集到的200例正常男女样本（男女比例为1∶1）的外周全血DNA,运用Ampliseq扩增技术以及Life Technologies耳聋基因检测引物池构建基因文库后进行下一代测序,确保每一个样本的测序结果获得足够的数据量,然后分析耳聋基因突变位点。结果建立了使用Life Technologies耳聋基因检测引物池构建基因文库的实验体系;经过数据比对,筛选出200例样本中突变率高达80%-100%的良性等位基因突变点。结论通过对测序结果的分析处理,筛除了针对广东地区人群突变率高但是不致病的良性耳聋基因突变位点,为今后广东地区人群的耳聋基因突变筛查提供参考。

促黄体生成素定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的临床性能评价

目的对广州市达瑞生物技术股份有限公司的促黄体生成素定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)进行临床应用研究及临床性能评价。方法采用平行、盲法、对照试验设计,用达瑞生物公司试剂盒检测335例样本,以雅培公司的促黄体生成素测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)作为对照试剂盒,罗氏公司的促黄体生成素检测试剂盒(电化学发光法)作为复核试剂盒。操作按各试剂盒说明书进行,对达瑞生物公司试剂盒的符合率和相关性进行计算分析。结果同雅培公司试剂盒比较,达瑞生物公司试剂盒检测血清样品异常符合率为95.8%,正常符合率为95.2%,总符合率为95.4%,Kappa值为0.898(P<0.01)。线性回归方程为Y=0.358+0.961X,两者测定值接近,相关系数为0.988(P<0.01),相关性良好。同血清检测结果相比,血浆检测结果 Kappa值为1.000(P<0.01),线性回归方程为Y=0.120+0.966X,相关系数r值为0.999(P<0.01),相关性良好。特异性样本检测结果均为正常。结论本试剂盒检测性能可以满足临床应用的需要。

329例胎儿常见染色体非整倍体的快速检测

目的:评价定量荧光PCR(QF-PCR)技术在常见染色体非整倍体病诊断中的价值。方法:对329例因唐氏筛查高风险、无创产前基因检测高风险或高龄等行介入性产前诊断的羊水标本,用QF-PCR方法快速检测21、18、13、X、Y染色体的数目,并与金标准染色体核型分析进行对比。比较两种方法的检测结果,分析QF-PCR技术的灵敏性和特异性。结果:329例羊水标本中,染色体核型分析检测到5种染色体非整倍体87例,其中1例为21、13罗伯逊易位型的21三体;QF-PCR方法检测5种染色体非整倍体87例,与核型分析结果完全一致。结论:QF-PCR技术对于21、18、13、X、Y染色体数目异常的检测具有较好的灵敏性、特异性和准确性,是一种简单、快速、可靠的染色体非整倍体分子诊断技术,可用于染色体非整倍体快速产前诊断。

总前列腺特异性抗原定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的性能验证

目的对自制的总前列腺特异性抗原(total prostate specific antigen,t PSA)定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)进行性能验证,判断自制试剂盒是否满足产品行业标准要求。方法参照产品行业标准要求,对自制试剂盒的准确度、最低检测限、线性、重复性、批间差、稳定性、配对抗体等克分子反应性进行考察。结果自制试剂盒的最低检测限为0.0022 ng/m L,线性相关系数r=0.9998,重复性为2.82%和1.96%,批间差为5.55%,配对抗体等克分子反应小于15%,均符合产品标准的要求。对刚过12个月有效期的产品进行以上项目检测,也符合产品标准要求,说明效期内试剂质量稳定。结论自制试剂盒的各项性能指标符合行业标准要求,在线性、最低检测限和检测范围方面比临床常用的罗氏t PSA电化学发光试剂盒更优,可替代国外昂贵试剂应用于临床检测。

游离β人绒毛膜促性腺激素定量测定化学发光免疫分析法的建立与性能评价

目的建立一种定量测定游离β人绒毛膜促性腺激素(freeβhuman chorionic gonadotrophin,f-β-h CG)的化学发光免疫分析法,并对其性能进行评价。方法利用双抗体夹心法,对反应步骤进行筛选,建立游离β人绒毛膜促性腺激素定量测定的化学发光免疫分析法,并对其最低检测限、准确度、重复性、批间精密度、特异性、参考范围及样本比对进行评价。结果经过筛选,选用了二步法反应步骤;对f-β-h CG试剂盒进行方法学评价,最低检测限可达0.006 ng/m L,准确性相对偏差在2.56%～4.43%,线性在0～200 ng/m L,相关系数R^2=1,重复性CV值均小于8%,批间CV值均小于15%;与罗氏的游离β-绒毛膜促性腺激素定量测定试剂盒(电化学发光法)测定结果显著相关,一致性达0.965,线性回归方程为y=1.131x+0.826,相关性r值为0.992,2种试剂盒的检测结果具有较高的一致性。结论本研究自制试剂盒的各项性能均能符合临床检验的要求,有望能替代昂贵的进口试剂应用于临床检测及研究。

11339例孕妇无创产前检测结果对比分析

目的探讨不同年龄段及不同高危因素孕妇无创产前检测结果的对比分析。方法回顾性分析2014年12月至2015年8月进行无创产前检测的11 339例孕妇资料,分别计算21、18、13号染色体发生变异的概率。将孕妇按年龄段（〈35岁组,35-39岁组和≥40岁组）、孕产史（无不良孕产史组和有不良孕产史组）、受孕情况（自然受孕组和试管婴儿组）分组,分别比较各组间的胎儿患21、18、13-三体综合征的概率。结果 11 339例样本中共检出82例胎儿染色体异常者,占样本总数7.2‰（82/11 339）,其中,21-三体最常见,所占比例为67.07%（55/82）。≥40岁组阳性发生率2.45%,较〈35岁组（0.59%）和35-39岁组（0.61%）差异有统计学意义（P〈0.001）。孕产史和受孕情况2组的阳性发生率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论高龄孕妇是胎儿患染色体非整倍体疾病的重要危险因素,应提高无创产前检测在此类人群中的应用。

肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用

目的本研究拟在评估二代测序(next generation sequencing,NGS)技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性。方法本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本(formalin fixed paraffin embedded,FFPE),同时进行一代测序(sanger sequencing)和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况。结果在108例肺癌样本中,一代测序检出突变在二代测序中均检出,另外NGS还检测出目标区域外其他突变。结论 NGS的检测准确性可达到100%。NGS可以应用于肺癌临床分子诊断,同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息,为分子靶向治疗提供依据,更具有市场潜力及应用前景。

一种基于母血浆的新型冠状病毒核酸检测体系的建立

目的通过改良染色体非整倍体无创产前检测(Non-Invasive Prenatal Testing,NIPT)的文库构建方法,开发一种基于母血浆的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测方法,实现NIPT与SARS-CoV-2的整合性筛查。方法收集2020年7月1日-2020年9月30日在长沙市妇幼保健院就诊行NIPT检测的孕妇50例,将孕妇血浆等分为两份,一份常规提取游离DNA,另一份提取SARS-CoV-2核酸并逆转录,两种提取物等比例混合后按照NIPT常规流程进行扩增、测序和分析。改良测试文库分为三组,正常孕妇组,三体孕妇组和模拟SARS-CoV-2孕妇组,其中模拟SARS-CoV-2孕妇组又设置三个不同的病毒浓度梯度。结果①正常孕妇组所有样本NIPT检测均为阴性,三体孕妇组4例为21三体、4例为18三体、1例为13三体、1例为21三体合并13三体,均与实际相符。②模拟SARS-CoV-2孕妇组三个病毒浓度梯度均可实现SARS-CoV-2核酸的检测,且NIPT检测结果为阴性,与实际相符。③SARS-CoV-2序列占比与病毒拷贝数的相关系数为0.997,提示该方法有潜力用于SARS-CoV-2的定量或半定量分析。结论本研究开发的NIPT-SARS-CoV-2技术可以在孕妇常规产检过程中,采集一管外周血即达到NIPT检测和孕妇SARS-CoV-2核酸检测的目的,实现孕产妇这一易感人群的SARS-CoV-2全面筛查,保证孕妇和新生儿得到最优化的管理与救治。

非小细胞肺癌组织中ALK、ROS1、RET融合基因检测方法的比较

非小细胞肺癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率中高居榜首,是中国首要的一个公共卫生问题。近年出现的分子靶向药能显著改善非小细胞肺癌患者的生存质量,因此对患者突变基因的准确检测显得尤为重要。目前临床上检测非小细胞肺癌患者ALK、ROS1、RET融合基因的主要方法有荧光原位杂交、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应以及新兴起的下一代测序,但这4种方法优缺点各异。本文通过比较这几种常见的检测方法,为融合基因检测方法的选择提供参考。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症研究进展

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症是临床常见的遗传性酶缺陷疾病,遗传方式为伴X染色体不完全显性遗传。其发病已知与摄入氧化性食物、药物或感染有关,不同个体的酶活性及临床表现有极大差异,可由无症状至严重的急性溶血性贫血,新生儿可能因高胆红素血症诱发神经系统的永久性损伤。实验室检查以酶学及基因诊断为主。目前该病无法治愈,治疗有赖于预防和对症支持治疗。现今研究有望通过改善G6PD稳定性缓解严重的G6PD缺乏。

p53基因突变检测方法的演进和趋势

p53基因是肿瘤蛋白P53(tumor protein p53)的编码基因,在维持基因组稳定、调控细胞周期和凋亡及抑制肿瘤血管生成中发挥着重要的作用。p53基因突变信息在肿瘤分子筛查诊断、预防、药物疗法选择等方面具有重要的参考价值。本文分析了p53基因与P53蛋白突变检测的重要性、突变检测方法的发展概况,如传统的DNA测序、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、单链构像多态性(single-stranded conformation polymorphism,SSCP)等8类实验室常规基因突变检测策略及酵母中分离的等位基因功能分析技术(separation of gene function analysis in yeast,FASAY),近年来新兴的技术包括生物传感器、芯片、高分辨率溶解曲线(high resolution melting,HRM),及下一代测序技术,以期较为全面地展示现今p53及P53突变检测的整体情况,为p53或其他基因突变研究者选择突变检测方法提供参考。

基于下一代测序平台的结直肠癌KRAS基因检测

目的基于下一代测序技术,检测和分析结直肠癌KRAS基因的突变情况,以及评估其应用于临床分子诊断中的可行性。方法应用Ion Proton半导体测序仪,检测108例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样本的KRAS基因突变情况,并与作为金标准的一代测序检测结果进行对比。结果下一代测序检测结果与一代测序检测结果基本一致,符合率为94%,灵敏度高达100%。结论通过对108例临床样本的检测分析后,该下一代测序检测方法可用于检测结直肠癌KRAS基因突变情况。